简介
特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析是放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析的一种方法。如果在细胞裂解后，利用特异性抗体进行免疫沉淀后再行酸水解，放射性自显影的信号则可以确定该种蛋白在哪种氨基酸残基上发生了磷酸化。如果 1 条多肽链中只有 1 个丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸被磷酸化，磷酸化位点的确定比较容易，但是在大多数情况下，蛋白质都存在数个磷酸位点，使得分析比较困难。
原理
特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析的基本原理是：为在多个磷酸化位点情况下完成分析，需要先将肤链进行适当的水解，对获得的较短的肽段进行磷酸氨基酸分析，方可获知磷酸化位点。
用途
随着人类基因组计划的完成，各种蛋白质的一级结构已经清晰、商品化的针对特定蛋白质的抗体众多，这种针对特定蛋白的磷酸化研究目前在实验室更为常用。
材料与仪器
试剂：
1、细胞裂解缓冲液： 50 mmol/L Tris－HCI （ pH 7.4）， 100 mmol/L NaCI， 1％ NP－40 ， 1％ DOC， 0.1％ SDS， 10 mmol/L EDTA，临用前加入 1 mg/ml leupeptin 和 aprotinin， 200 mmol/L Na3 VO4 和 1 mmol PMSF。
2、细胞裂解液，包含蛋白酶、磷酸酶制剂的非离子去垢剂裂解液。
3、SDS－PAGE 上样缓冲液。
4、HCL，6mol/L 。
5、磷酸氨基酸标准品，包含非放射性磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸混合。
6、 pH 1.9 电泳缓冲液：50 ml 88％ 甲酸， 156 ml 冰乙酸， 1794 ml H2O， 密封室温保存。
7、pH 3.5 电泳缓冲液：100 ml 冰乙酸， 10 ml 嘧啶， 10 ml 100 mmol/L EDTA， 1880 ml H2O，密封室温保存。
8、 0.25％ 茚三酮丙酮溶液
步骤
特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析的的基本过程可分为如下几步：
A、免疫沉淀：完成 32 P 细胞内标记后，弃去液体。加入细胞裂解液（含蛋白酶、磷酸酶制剂的非离子去垢剂裂解液），用细胞刮辅助收集裂解细胞（悬浮细胞可直接离心收集），离心收集上清，加入所需要的特异性抗体进行免疫沉淀，按常规收货免疫复合物，用 SDS－PAGE 上样缓冲液溶解免疫复合物。
B、获取磷酸化蛋白：将免疫复合物溶液进行单向或双向 SDS－PAGE， 电泳完成后将蛋白质转移至 PVDF 膜，做好方向标记后（可用商用荧光显影记号），放射自显影，按照显影信号将预期含有 32 P 磷酸化蛋白的膜剪下。
C、酸水解：将膜放入一个小的耐高温塑料螺口带盖离心管内（可用细胞冻存管），加入甲醇使膜湿润，再用水润洗 1 次。加入足够量的 6 mol/L HCL 盖住膜，旋紧管盖，110 ℃ 孵育 60 min。自然冷却，离心，取上清放在另一新的小离心管内，真空离心干燥。
D、层析样品准备：在干燥的样品中加入 6～10 ul H2O， 在涡旋混合器上剧烈混匀，溶解样品，高速离心沉淀不溶物。
E、薄层层析：在薄层层析容器内，用 20 cm x 20 cm x 100 um 纤维素薄层层析板 （可用商品化板）进行 ，每块薄层板可加 4 个样品。加样需要小量多次完成，反复微风干燥，使点样点的样品扩散直径尽可能小。在每个样品点处，点加 1 ul 磷酸氨基酸标准品（非放射性磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸混合）。用 pH 1.9 层析缓冲液进行笫一向层析、pH 3.5 层析缓冲液进行笫二向层析。
F、放射自显影：取出薄层板，在 50～80＂C 烤箱内放至完全干燥。喷涂 0.25％ 茚三酮丙酮溶液，再加热 5～10 min， 使磷酸氨基酸标准品呈色。做好方向标记，使用增感屏， －70＂C 自显影。与标准品相比较即可得知所分析的特定蛋白中的磷酸氨基酸种类。
注意事项
所有操作需要在放射性核素操作专用实验室进行，并严格执行相关规定。
来源：丁香实验
