免疫复合物的体外激酶活性测定

最新修订时间：2022-02-10

简介

体外蛋白激酶活性测定（in vitro kinase assay）实际上是在无细胞体系中利用 γ－32 P－ATP 作为磷酸基团供体进行的蛋白质磷酸化分析。

原理

免疫复合物的体外激酶活性测定的基本原理是：在反应过程中，蛋白激酶催化平 γ－32 P－ATP 分子中的带有 32 P 的 γ－磷酸基团转移到蛋白质底物的相应氨基酸残基上，利用放射自显影即可确定底物的磷酸化，进而确定蛋白激酶的活性。在蛋白激酶活性测定中，除了 γ－ 32 P－ATP 分子作为供体底物以外，还需要有可被磷酸化的蛋白质或多肽作为磷酸基团的受体。不同蛋白激酶的底物不同，有些蛋白激酶具有以自身为底物的自我磷酸化能力，可以自身为底物来定酶活性；大部分蛋白激酶则需要加入外源底物。

用途

外源底物常通过基因工程表达来制备， GST 标签由于纯化简便，常被用来表达蛋白激酶底物的融合蛋白。用于激酶活性测定的底物一定要含有可被该激酶磷酸化的磷酸化位点或模体。体外激酶分析原理可以用于多种形式的实验，既可以用于免疫沉淀复合物内蛋白激酶的活性测定，也可以用于纯化或部分纯化的蛋白激酶的活性检测。

材料与仪器

试剂：

1、细胞裂解液： 20 mmol/L Tris－HCl （pH7.5）， 150 mmol/L NaCl，0.5％ Triton X－100，临用前加入 2 mmol/L Na3VO4 ，30 mmol/L 焦磷酸钠， 50 mmol/L NaF， 1 mmol/L PMSF。

2、激酶反应液： 30 mmol/L Tris－HCl（pH 7.4），10 mmol/L MgCl2， 2 mmol/L MnCl2， 3.7 MBq/ml ［γ－32P］ ATP （111～222 TBq mmol）。

步骤

免疫复合物的体外激酶活性测定的基本过程可分为如下几步：

A、收集细胞并以细胞裂解液裂解细胞，离心收集上清， BCA 法定量蛋白质，取总蛋白含量为 500～1500 ug 的细胞裂解液用于免疫沉淀（所有反应管应使用同等量蛋白质）。

B、加入 20 ul 蛋白 A/G－琼脂糖珠，4 ℃ 混匀孵育 30 min 进行预清除，以减少非特异性结合。

C、 4 ℃、2500 g 离心 30 s，收集上清，加入 2～4 ug 特异性抗体，4 ℃ 振摇孵育过夜。

D、加入 20 ul 蛋白 A/G－琼脂糖珠， 4 °C 混匀孵育 2 h。

E、用冷细胞裂解液（不含各种抑制剂）反复离心洗涤琼脂糖珠 3 次，用不含 ATP 的激酶反应液洗涤 1 次。

F、用 40 ul 激酶反应液重悬琼脂糖珠， 37 ℃ 孵育 10 min，加入 10 ul 5 x SDS－PAGE 上样缓冲液，迅速混匀， 95 ℃ 处理 3 min，离心，上清用于 SDS－PAGE。

G、干胶，放射自显影。

注意事项

所有操作需要在放射性核素操作专用实验室进行，并严格执行相关规定。

来源：丁香实验