活性氧自由基和清除体系活性分析

蛋白质实验

最新修订时间：2023-03-22

简介

活性氧自由基是机体氧化反应过程中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞。自由基通过氧化作用攻击生物大分子物质，导致 DNA、蛋白质、脂膜等结构损伤，与退行性疾病、心血管疾病、肿瘤发生等密切相关。细胞内源性的自由基清除系统，如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶等，有助于清除体内的自由基，降低自由基对细胞的危害。

目前活性氧自由基和清除体系活性分析的实验方法有 2 种：活性氧分析和谷胱甘肽含量测定。

原理

根据实验方法不同，对应的原理也有所不同：

方法一：活性氧分析的基本原理是：利用荧光探针 DCFH－DA（2^＇，7^＇－二氯二氢荧光素二乙酸酯）可进行 ROS 的检测。DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，被细胞内的酯酶水解生成 DCFH。DCFH 不能通透细胞膜，被细胞内的 ROS 氧化成有绿色荧光的 DCF。DCF 的荧光强弱可反映细胞内 ROS 水平。

方法二：谷胱甘肽含量测定的基本原理是：丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）能够催化将氨基从丙氨酸转移到 aα－KG 上的转氨基反应，这个可逆转氨基反应的产物为丙酮酸和谷氨酸，在氨基酸代谢中具有重要作用。哺乳动物肝细胞中 ALT 酶活性很高，当肝细胞坏死，ALT 被释放到血液，血清 ALT 活性显著增高。因此，ALT 被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。ALT 催化丙氨酸和 α－KG 的转氨基反应，生成丙酮酸和谷氨酸；加入 2,4－二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在碱性条件下呈红棕色，可以在 505 nm 读取吸光度值并计算酶活性。

来源：丁香实验团队

操作方法

DCFHDA 检测细胞内总活性氧

（1）准备待检测细胞，计数细胞，调整细胞数量为 1×106 个/mL；（2）PBS 润洗三次，加入新鲜 DMEM 培养基（根据细胞选择合适培养基）；（3）加入终浓度为 0.5 μM 的 DCFHDA 探针，室温下避光孵育 30 min；（4）PBS 润洗三次，去除细胞外残留 DCFHDA 探针；（5）加入无酚红 DMEM 培养基（根据细胞选择合适培养基），流式细胞仪检测。使用 488 nm 激发波

MitoSOX 测定线粒体活性氧

（1）准备待检测细胞，计数细胞，调整细胞数量为 1×106 个/mL；（2）PBS 润洗三次，加入新鲜 DMEM 培养基（根据细胞选择合适培养基）；（3）加入终浓度为 5 μM 的 MitoSOX 探针，室温下避光孵育 30 min；（4）PBS 润洗三次，去除细胞外残留 MitoSOX 探针；（5）加入无酚红 DMEM 培养基（根据细胞选择合适培养基），流式细胞仪检测。