PBMC 细胞的精确计数和活性分析
北京达科为生物
一、PBMC细胞计数的现状
1. 目前，绝大多数的科研工作者仍在使用血球计数板 在显微镜下进行手工计数 PBMCs；
2. 但是显微镜下由于白细胞和红细胞大小非常接近， 不能完全区分白细胞和红细胞；
3. 通过红细胞的双凹形形态鉴别红细胞，需要经验丰 富的操作者，且不停地调焦来鉴别；可想而知要把每个 红细胞鉴别出来，要耗费多长的时间，需要多强的工作量。
PBMC样本的差异性大 由于个体的差异（如正常人和病人）和人工分离提取的差异，红细胞和血小板污染的程度差异性非 常大，因此我们经常看到分离后的PBMC样本千差万别（见下图），这也大大增加了在同一条件下， 简单快速准确计数PBMC的难度和检测 PBMC活性的难度。
如在癌症免疫治疗领域中，需从病人全血中分离出 PBMC，分离的PBMC进一步扩增或进行不同的 功能检测。激活扩增后的细胞再回输到病人体内进行细胞治疗。在整个流程中，从分离到检测，到 培养，到回输等过程，细胞浓度和细胞活力都是必须监测的参数。
密度梯度分离液是从外周血、骨髓，及脐血分离单个核细胞最常用的方法。但是不可避免的，分离 后的细胞中，会有残存的红细胞及血小板混合在单个核细胞中。残存的红细胞和血小板的多少，个体的差异，以及分离的效果相关；但是不管分离的技术多高超，经验多丰富，都不可避免会存在红细胞和血小板的污染。PBMC实验的特征：
1. 随着时间的延长，细胞质量下降；
2. 临床试验相关的样品量很大；
3. 细胞样品不纯，分离之路依赖病人样本和操作者
计数 PBMC以及精确分析PBMC活力：
1. 使用血球计数板在显微镜下进行手工计数 PBMC，即耗时耗人力，更不能达到精确计数的目的。
2. 通过明场的常规细胞计数仪同样不能区分红细胞，不能达到精确计数PBMC和精确活力分析的 目的。
3. 迫切需要快速、简便、精确计数PBMC的工具替代人工计数。Nexcelom公司走在了市场领先的 位置，在常规明场的细胞计数仪基础上，开发出了双荧光细胞活力分析仪，可通过 AOPI染料进 行 PBMC的快速精确计数和活力分析。
参考文献
1. PreliminaryReport:EvaluationofStorageConditionsandCryococktailsduringPeripheralBlood MononuclearCellCryopreservation",L.M.Cosentino,W.Corwin,J.MBaust,N.Diaz-Mayoral,H.Cooley,W. Shao,R.Van Buskirk,and J.GBaust,CellPreservationTechnology,Volume5Number4,2007
2. "ViabilityandFunctionalActivityofCryopreservedMononuclearCells",A.Weinberg,L.Zhang,D.Brown,A.
Brice,B.Polsky,M.S.Hirsch,S.Owens,and K.LambClincaland DiagnosticLaboratoryImmunology,July,
2000,P714-716
3. "Celllossandrecovery inumbilicalcordbloodprocessing:acomparisonofpostthawandpostwashsamples", V.Laroche,D.H.McKenna,G.Moroff,T.Schierman,D.Kadidlo,andJ.McCullough,Transfusion,Vol.,45, Dec.2005.
4. "ViabilityandRecoveryofPeripheralBloodMononuclearCellsCryopreservedforup to12Yearsina MulticenterStudy",C.A.Kleeberger,R.H.Lyles,J.B.Margolick,C.R.Rinaldo,J.P.Phair,andJ.V.Giorgi, ClinccalandDiagnosticlaboratoryImmunology,Vol.6,No.1,Jan.1999.
三、如何精确计数PBMC和活力分析检测
通过AOPI染料进行双荧光计数和活力分析，是可以排除红细胞、血小板、细胞碎片等污染的精确 计数方法。O（吖啶橙）和 PI（碘化丙啶）是可对 DNA染色的细胞核染色试剂。其中 AO可以通过完整的细 胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。
活死单个核细胞可呈现荧光信号。而成熟的 红细胞及血小板，因为没有细胞核，不能被 AO/PI 染色，因此可以完全被排除在外不被 计数。
通过 AOPI染料进行双荧光计数和活力分析，可以精确计数分离后的 PBMC以及活力分析，亦可进 行全血中的PBMC。
四、Cellometer细胞计数和活力分析仪器型号选择
1. 双荧光计数和活力分析是 PBMC计数的最佳选择方法。
三款仪器型号可选：AUTO2000/K2/ VISIONCBA，可精确、快速、简便进行 PBMC计数和活力分析。
2. 明场的自动细胞计数仪进行PBMC计数，可通过台盼蓝排斥法进行 PBMC的活力检测。
虽然也能达到自动、快速的目的，但是仍无法有效的排除红细胞的干扰，达到精确计数的目的。 台盼蓝排斥法检测细胞死活，是通过台盼蓝这个细胞活性染料，其不能透过活细胞正常完整的 细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内， 使死细胞着色呈蓝色。
是最常用的检测细胞活率的方法。 但是台盼蓝排斥法并不能精确计数活死细胞，原因是细胞膜通透性不一样，进入细胞内的染料 差异也很大，所以经常会出现很难判定是死细胞还是活细胞。
如果对PBMC计数的准确性要求不是很高，但是需要快速、自动计数，而且对实验的一致性和 重复性的要求高，可选择以下三款计数仪：AUTO1000/MINI/AUTO T4。
1. Chan, L.L.,Wilkinson,A.R., Paradis,B.D.andLai,N.(2012b)RapidImage-basedCytometryforComparison ofFluorescentViabilityStainingMethods.JournalofFluorescence22,1301-1311.
2. Almeida,C.-A.M.,Roberts,S.G.,Laird,R.,McKinnon,E.,Ahmed,I.,Pfafferott,K.,Turley,J.,Keane,N.M., Lucas,A.,Rushton,B.,Chopra,A.,Mallal,S.andJohn,M.(2009)Automationofthe ELISpotassayfor
high-throughputdetectionofantigen-specificT-cellresponses.JournalofImmunologicalMethods344,1-5.
3. Constantino,B.T.and Cogionis,B.(2000)NucleatedRBCs-Significanceinthe PeripheralBloodFilm.
LaboratoryMedicine31,223-229.
4. Laroche,V.,McKenna,D.H.,Moroff,G.,Schierman,T.,Kadidlo,D.andMcCullough,J.(2005)Celllossand recoveryinumbilicalcordbloodprocessing:acomparisonofpostthawand postwashsamples.Transfusion
45,1909-1916.
5. Sigfusson,A.and Souhami,R.(1984)The EffectsofErythrocyteContaminationonPokeweedMitogen
InducedImmunoglobulin-SynthesisinMan.JournalofImmunologicalMethods72,167-170.
6. Szabo,S.E.,Monroe,S.L.,Fiorino,S.,Bitzan,J.andLoper,K.(2004)EvaluationofanAutomated Instrument forViabilityand ConcentrationMeasurementsofCryopreservedHematopoieticCells.Laboratory Hematology10,109-111.
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