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阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的 DNA
从琼脂糖凝胶中回收的 DNA 片段,如 PCR 产物或酶切 DNA 片段,对进一步酶切具有一定的抗性。这种抗性产生的原因是多方面的,通常将其归为抑制剂的存在。经带正电荷的离子交换树脂纯化的双链 DNA 可有效去除样品中的抑制剂。在低离子强度的缓冲液中,带负电的 DNA 结合到带正电的基质上。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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酿酒酵母的生长及其 DNA 的制备
用这一方法制备的 DNA 适用于琼脂糖凝胶电泳、Southern 印迹、亚克隆、基因组文库构建、PCR 或其他不需要完整的高分子质量 DNA 的方法。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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酵母 DNA 的小量制备
通过消化细胞壁,然后用 SDS 裂解随之产生的原生质体就可以制备酵母 DNA。用这种方法可重复性地制备若干毫克的酵母 DNA。得到的酵母 DNA 可被限制性内切核酸酶切割,也可用作 PCR 的模板。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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利用 PCR 分析酵母菌落
利用PCR分析酵母菌落主要用于确定酵母中是否携带目的DNA序列。
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高容量载体中基因组 DNA 片段末端的分离(小载体 PCR)
许多真核生物的基因所包含的 DNA,远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说,更是如此。因此,必须构建一套重叠的 DNA 克隆,这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列(叠连群),可以涵盖一个很大的基因或目的区域。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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琼脂糖凝胶中 DNA 的检测
琼脂糖凝胶中的核酸通过染色,可以在波长为 300 nm 的紫外灯下检测。介绍琼脂糖凝胶中核酸染色的两种方法:溴化乙锭(ethidium bromide, EB ) 染色法和 SYBR Gold 染色法。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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寡核苷酸 5' 末端磷酸化实验
以下介绍的是标记 10pmol 高比活度的寡核苷酸的反应,标记不同量的寡核苷酸可以通过增加或减少反应体积而保持各组分的相应浓度来实现。也可用类似的反应条件,将非放射性的磷酸加到用于定点突变的合成寡核苷酸 5'末端。本实验来源于分子克隆实验指南(第三版)上册,作者:黄培堂。
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CPB 沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸实验
本方案介绍用阳离子去污剂——十六烧基溴化吡啶(cetylpyridinium bromide,CPB) 定量差异沉淀分离放射性标记的寡核苷酸与未掺入的放射性标记物。此方法最初是用于回收磷酸缓冲液从羟磷灰石柱洗脱的 DNA(Geek and Nasz 1983), 也可用于沉淀放射性标记核酸包括寡核苷酸。本实验来源于分子克隆实验指南(第三版)上册,作者:黄培堂。
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λ噬菌体臂与外源基因组 DNA 片段的连接实验
当 λ 噬菌体臂与外源基因组 DNA 片段相连时,必须考虑到两个参数:噬菌体臂与潜在插入片段的摩尔比,以及在反应混合物中各类 DNA 的浓度。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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噬菌体 DNA 从噬菌斑到滤膜的转移实验
一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法,在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法,包括通过用 32P 标记的探针进行原位杂交以大量筛选噬菌斑。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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噬菌体 DNA 在滤膜上的杂交实验
通过用 32P 标记探针的原位杂交,可筛选携带有固定化 DNA 的滤膜,这些 DNA 来源于噬菌斑。该技术是强有力的、高度特异的和很灵敏的,能从数千个噬菌斑中鉴别出单一的重组子。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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λ噬菌体分离物的快速分析(从液体培养物中纯化 λDNA)实验
如本方案所述,λ 噬菌体 DNA 可很容易地从液体培养物中纯化出来。而前一个方案则阐述了从平板裂解物中纯化 λ 噬菌体 DNA 的方法。一般来说,λ 噬菌体在液体培养物中的生长不如平板裂解物中的。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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M13 噬菌体铺平板
M13 噬菌斑是由单个病毒感染单个细菌后形成的。子代病毒颗粒感染邻近细菌, 然后又产生下一代病毒颗粒,细菌在半固体培养基(如含琼脂或琼脂糖)上生长时,子代病毒颗粒的扩散受到一定限制。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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P1 噬菌体及其克隆系统的应用
P1 噬菌体与 λ 噬菌体同年被发现(Bertani 1951)。两种噬菌体在天然宿主中都是温和噬菌体,它们在实验室的研究历程也几乎相同。λ 噬菌体一经被发现,立刻就被当时有影响的实验室选作分子水平研究溶原性噬菌体的模型。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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M13 噬菌体液体培养
M13 噬菌体原种通常采用液体培养,感染细胞并不裂解而是缓慢生长形成稀悬液。接种几乎总是用一个新挑取的噬菌斑或单个噬菌斑获得的噬菌体颗粒悬液。感染细胞含 200 拷贝以上双链 RF DNA,每代分泌数百个噬菌体颗粒。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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M13 噬菌体双链(复制型)DNA 的制备
感染 M13 噬菌体的细菌含病毒双链 RF DNA,培养基中粗提病毒颗粒中含单链子代 DNA,双链 RF DNA 可以采用类似于质粒纯化的方法从感染细胞的小量培养物中分离。从 1~2 ml 的感染细胞培养物中可以分离几微克的 RF DNA,这个量足以进行亚克隆和作限制酶酶切图谱。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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M13 噬菌体单链 DNA 的制备
M13 噬菌体单链 DNA 是从感染细胞分泌至周围培养液中的病毒颗粒中制备的,首先在高盐存在下,丝状病毒被聚乙二醇(PEG) 沉淀浓缩,然后用酚抽提释放单链 DNA,最后乙醇沉淀收集单链 DNA。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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单链和双链 M13 噬菌体 DNA 的大规模制备
这个方案主要用于制备大量 M13 噬菌体的双链 DNA,因在实验室中 M13 噬菌体经常被用作克隆载体,以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬菌体 DNA,如当一个特定的重组体被多次用于制备反射性标记探针或构建大量定点突变体时。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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细胞提取物中 β-半乳糖苷酶的测定实验
本方案介绍报道分子载体(请见图 17-5) 转染哺乳动物细胞后,测定表达的β-半乳糖苷酶活性。本方法既简单快速,又可以用可见光分光光度计进行测定。本实验来源于分子克隆实验指南(第三版)下册,作者:〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。
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M13 噬菌体载体的克隆
虽然理论上 M13 重组噬菌体所能携带的外源 DNA 片段没有限制,但实际上是有限的:长片段的外源 DNA 比短片段的更易发生缺失和重排。因此如果可能,最好克隆至 M13 噬菌体的 DNA 片段不要大于 1000 碱基。而且,当用“正向”或“反向”通用测序引物进行 DNA 测序时,大片段的中心区域可能位于所能测到的区域外。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
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