免疫学实验

通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞，是基于一种重要染料 Hoechst 33342 可被干细胞泵出的特征，从小鼠骨髓分离出造血干细胞。目前，通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞采用流式细胞术。

细胞凋亡是调节细胞的动态平衡，流式细胞仪的多参数特性可对同一标本中数个细胞凋亡指标同时进行测定，为分析不同细胞复杂的凋亡过程提供了一个有力的工具。目前，分析细胞凋亡方法采用流式和影像细胞术。

细胞毒性淋巴细胞，是通过释放含有穿孔素和颗粒酶的颗粒和 (或) 通过 Fas-Fas 配体的相互作用杀伤靶细胞。目前，评估淋巴细胞介导的细胞毒作用的方法采用流式细胞术。

基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析是以β-内酰胺酶-Vpr 查嵌合蛋白质掺入 HIV 病毒为基础，并以其后继进入靶细胞的胞质作为融合的标志。这种融合蛋白的转移可以由酶裂解 CCF2-AM 染料的方法来监测。目前，基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析实验主要包括 3 种：含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备、基于 FRET 的 HIV-1 病毒粒子的融合试验

研制重要生物活性分子的亲和性试剂是最重要的，也是生物学家面临的最具挑战性的任务。本章描述了单链抗体可变区基因片段（scFv）酵母菌表面表达文库的建立，这一方法可部分解决该问题。该方法最初由 Feldhaus 等所描述。酵母菌展示技术平台是由麻萨诸塞州技术学院 Wittrup D. 等建立的，使用 a-凝集素黏附受体显示啤酒酵母菌表面的重组蛋白质。酵母菌表面展示 scFv 抗体技术还已经被成功用于从

现在已有几种软件包用于流式细胞仪数据分析。尽管每一个在处理数据时方法各异，但是基本策略是近似的。由于随着参数的增加，分析也变得愈加复杂，因此我们集中介绍一种经典的分析手段以及可以对各种流式细胞术参数通用的分析方法。

流式细胞仪通常利用表型分析对细胞群进行分析与鉴定，或对细胞分析相关的项目进行检测，如细胞毒活性、细胞活力及凋亡等。对于利用流式细胞仪来评价或分析复杂细胞群体，如外周血中的细胞亚群是很方便的。在当前蛋白组学分析中, 二维的 SDS-PAGE 凝胶电泳和蛋白翻译后修饰的质谱分析主要是对胞内活化过程进行分析。但是，这些实验的示值读数显示的是细胞被溶解后所有细胞蛋白活化的均值，并不能对细胞群体中单细胞蛋白

虽然显微镜的使用在 17 世纪让我们认知了微生物世界的存在，但是微生物的单细胞水平的研究一直未能突破，直到 20 世纪流式细胞术的出现才得以实现。目前，用于流式细胞仪测定革兰阴性和革兰阳性细菌生理状态实验的方法主要有 2 种：DiBAC4(3)/EB/PI 染色法检测大肠埃希菌和革兰阴性菌功能和 DiOC2（3）和 TOPRO3 法检测细胞的 AW 和膜的通透性。

通过细胞融合技术（如 PEG 诱导法）将产生单一抗体的一种免疫动物 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种由单个克隆细胞产生的抗体分子称单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。经 HAT 选择培养基的选择，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得

通过细胞融合技术（如 PEG 诱导法）将产生单一抗体的一种免疫动物 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种由单个克隆细胞产生的抗体分子称单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。经 HAT 选择培养基的选择，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得

芯片技术在基因表达调控研究中应用，是基因大规模的测序对基因调控的研究。目前，芯片技术在基因表达调控研究中应用的方法主要有2种：染色质免疫共沉淀－芯片/序列分析技术、和染色质构象捕获技术。

DNA 甲基化分析，是指在甲基转移酶的催化下，DNA中的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5'-甲基胞嘧啶常见于基因中的5'-CG-3'序列。目前，用于DNA 甲基化分析的方法主要有2种：甲基化特异性 PCR和亚硫酸盐修饰后基因组测序。

目前，用于启动子转录活性分析的方法主要有3种：报告基因技术分析启动子转录活性、核实时转录分析技术和cDNA的 5’-快速扩增技术分析启动子转录活性。

目前，用于转录调节蛋白与 DNA 的结合分析实验的方法主要有2种：凝胶迁移或电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术。

免疫细胞分离技术正向着越来越「精细」的方向发展，免疫细胞亚群乃至微量免疫细胞分离和鉴定技术也已成熟并在实验室得到应用，如通过免疫磁珠可以获得大量高度纯化的各种免疫细胞亚群，通过流式细胞仪可以分选到表达特定抗原的免疫细胞群体。当然，某些常规免疫细胞分离方法，如通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞等技术也非常简便和实用，仍被广泛应用，目前更多地用于免疫磁珠分选或者流式细胞仪分选之前的准备和细胞富集。总

巨噬细胞是体内重要的天然免疫细胞，体外检测其功能并不能完全反映其体内行为，而检测某些药物的实际效应，又往往需要体内测定巨噬细胞活性。以细菌内毒素 LPS 活化巨噬细胞为例，LPS 是一种脂类和多糖的复合物，是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是内毒素和重要群特异性抗原。LPS 通过诱导单核-吞噬细胞系统的活化，大量释放 TNFα、IL-6 等多种促炎症细胞因子导致脓毒症、脓毒症休克，甚至死亡的发生。TL

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前公认的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞（professional antigen presenting cell，APC）， 在免疫应答的首要环节--抗原提呈过程中扮演着重要的角色，是唯一能够活化初始 Th 细胞的 APC，成为适应性免疫应答的始动者；同时，DC 也在诱导机体的免疫耐受中发挥重要作用。在免疫稳定状态下，分布于外周非淋巴组织的 D

巨噬细胞（macrophages，MΦ）是由血液中单核细胞迁入组织后分化形成的成熟类细胞，广泛分布于脾脏、肝脏、腹腔、神经系统以及结缔组织等，具有吞噬杀伤、抗原提呈及免疫调节作用。近年的研究发现巨噬细胞在不同微环境中可以发生不同性质的活化，成为具有不同表面分子和功能特征的亚群。根据其不同的表型特点和功能特点及对 Th1/Th2 应答的诱导，通常将其分为两种类型：经典活化的巨噬细胞（classica

树突状细胞（dendritic cell，DC）是一种贴壁细胞，它在脾脏贴壁细胞中所占的比例小于 1%，细胞轮廓不规则，具有树枝状的突起。DC 不但存在于脾脏等外周淋巴器官中，也存在于外周血中。为了在体外研究 DC 的功能，需要对体内的 DC 细胞（主要是外周血、脾脏、淋巴结）进行分离、纯化。分离纯化 DC 的方法主要有两种：基于细胞物理性状的分离方法（如贴壁法）和基于细胞表面标记的分离方法（如

蜕膜免疫细胞群是母胎免疫耐受的生物学基础，其构成极为特殊，主要由特殊类型的 NK 细胞（CD56 hrighCD16-）（～70%）、T 细胞（～10%）和单核巨噬细胞（～15%）等组成，它们通过表达特殊活化标志和产生大量的细胞因子，在母胎界面局部发挥着不同于外周的免疫调节作用，形成 Th2 亚群免疫优势，并通过旁分泌作用调控滋养细胞的生长、分化和迁移，从而对妊娠的维持起重要的局部调节作用。