免疫学实验

流式细胞和基因表达谱两项技术具有很多共同特征：涉及复杂的高精尖设备；能够提供方法分析那些独特的、常规手段不易获得的细胞；需要大量的数据分析和归档功能。但是，在一个特殊的、重要的概念上它们也有所不同：当细胞混合在一起时，流式细胞术（细胞分选技术与其相似）通过分析细胞的光学特性，将它们分成同质的细胞群，留待进一步研究，从而降低了细胞混合物的复杂性。而全基因表达谱技术则提供了某一个特定生物标本内所有基因

Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干细胞特征是鉴于体外活体染料 Rhodamine123 (Rh123) 和 Hoechst 33342 (Ho) 已经被证实是分析原始造血干细胞 (PHSCs) 的特性，鉴定、分离和纯化的十分有效的探针，将与干细胞密切相关的群体区分开来。目前，分析造血干细胞特征采用方法为 Hoechst 33342 和 Rhodamine123

T 细胞通过 T 细胞抗原识别受体识别特定抗原分子（表位），机体的 T 细胞池虽然可以针对多种抗原表位产生应答，但针对一个特定的抗原表位只有特异性 T 细胞才能产生应答。与抗原提呈细胞上的 MHC-抗原肽复合体结合刺激 T 细胞后，T 细胞可以发生增殖反应并产生细胞因子。四聚体结合技术和酶联免疫斑点技术（ELISPOT）已被用于检测 T 细胞池中能与特定抗原肽结合或对特定抗原肽刺激分泌细胞因子的

细胞因子流式细胞术（Cytokineflowcytometry，CFC）是指应用抗细胞因子抗体来分析作为细胞活化标志细胞因子的流式细胞术的统称。此技术最常见的应用是对经体外短时间活化并固定和通透的细胞进行细胞内细胞因子的标记。当用特异抗原刺激时，此技术可以对稀有的抗原特异的T细胞进行定量分析。

通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞，是基于一种重要染料 Hoechst 33342 可被干细胞泵出的特征，从小鼠骨髓分离出造血干细胞。目前，通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞采用流式细胞术。

细胞凋亡是调节细胞的动态平衡，流式细胞仪的多参数特性可对同一标本中数个细胞凋亡指标同时进行测定，为分析不同细胞复杂的凋亡过程提供了一个有力的工具。目前，分析细胞凋亡方法采用流式和影像细胞术。

细胞毒性淋巴细胞，是通过释放含有穿孔素和颗粒酶的颗粒和 (或) 通过 Fas-Fas 配体的相互作用杀伤靶细胞。目前，评估淋巴细胞介导的细胞毒作用的方法采用流式细胞术。

基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析是以β-内酰胺酶-Vpr 查嵌合蛋白质掺入 HIV 病毒为基础，并以其后继进入靶细胞的胞质作为融合的标志。这种融合蛋白的转移可以由酶裂解 CCF2-AM 染料的方法来监测。目前，基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析实验主要包括 3 种：含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备、基于 FRET 的 HIV-1 病毒粒子的融合试验

研制重要生物活性分子的亲和性试剂是最重要的，也是生物学家面临的最具挑战性的任务。本章描述了单链抗体可变区基因片段（scFv）酵母菌表面表达文库的建立，这一方法可部分解决该问题。该方法最初由 Feldhaus 等所描述。酵母菌展示技术平台是由麻萨诸塞州技术学院 Wittrup D. 等建立的，使用 a-凝集素黏附受体显示啤酒酵母菌表面的重组蛋白质。酵母菌表面展示 scFv 抗体技术还已经被成功用于从

现在已有几种软件包用于流式细胞仪数据分析。尽管每一个在处理数据时方法各异，但是基本策略是近似的。由于随着参数的增加，分析也变得愈加复杂，因此我们集中介绍一种经典的分析手段以及可以对各种流式细胞术参数通用的分析方法。

流式细胞仪通常利用表型分析对细胞群进行分析与鉴定，或对细胞分析相关的项目进行检测，如细胞毒活性、细胞活力及凋亡等。对于利用流式细胞仪来评价或分析复杂细胞群体，如外周血中的细胞亚群是很方便的。在当前蛋白组学分析中, 二维的 SDS-PAGE 凝胶电泳和蛋白翻译后修饰的质谱分析主要是对胞内活化过程进行分析。但是，这些实验的示值读数显示的是细胞被溶解后所有细胞蛋白活化的均值，并不能对细胞群体中单细胞蛋白

虽然显微镜的使用在 17 世纪让我们认知了微生物世界的存在，但是微生物的单细胞水平的研究一直未能突破，直到 20 世纪流式细胞术的出现才得以实现。目前，用于流式细胞仪测定革兰阴性和革兰阳性细菌生理状态实验的方法主要有 2 种：DiBAC4(3)/EB/PI 染色法检测大肠埃希菌和革兰阴性菌功能和 DiOC2（3）和 TOPRO3 法检测细胞的 AW 和膜的通透性。

通过细胞融合技术（如 PEG 诱导法）将产生单一抗体的一种免疫动物 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种由单个克隆细胞产生的抗体分子称单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。经 HAT 选择培养基的选择，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得

通过细胞融合技术（如 PEG 诱导法）将产生单一抗体的一种免疫动物 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种由单个克隆细胞产生的抗体分子称单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。经 HAT 选择培养基的选择，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得

芯片技术在基因表达调控研究中应用，是基因大规模的测序对基因调控的研究。目前，芯片技术在基因表达调控研究中应用的方法主要有2种：染色质免疫共沉淀－芯片/序列分析技术、和染色质构象捕获技术。

DNA 甲基化分析，是指在甲基转移酶的催化下，DNA中的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5'-甲基胞嘧啶常见于基因中的5'-CG-3'序列。目前，用于DNA 甲基化分析的方法主要有2种：甲基化特异性 PCR和亚硫酸盐修饰后基因组测序。

目前，用于启动子转录活性分析的方法主要有3种：报告基因技术分析启动子转录活性、核实时转录分析技术和cDNA的 5’-快速扩增技术分析启动子转录活性。

目前，用于转录调节蛋白与 DNA 的结合分析实验的方法主要有2种：凝胶迁移或电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术。

免疫细胞分离技术正向着越来越「精细」的方向发展，免疫细胞亚群乃至微量免疫细胞分离和鉴定技术也已成熟并在实验室得到应用，如通过免疫磁珠可以获得大量高度纯化的各种免疫细胞亚群，通过流式细胞仪可以分选到表达特定抗原的免疫细胞群体。当然，某些常规免疫细胞分离方法，如通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞等技术也非常简便和实用，仍被广泛应用，目前更多地用于免疫磁珠分选或者流式细胞仪分选之前的准备和细胞富集。总

巨噬细胞是体内重要的天然免疫细胞，体外检测其功能并不能完全反映其体内行为，而检测某些药物的实际效应，又往往需要体内测定巨噬细胞活性。以细菌内毒素 LPS 活化巨噬细胞为例，LPS 是一种脂类和多糖的复合物，是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是内毒素和重要群特异性抗原。LPS 通过诱导单核-吞噬细胞系统的活化，大量释放 TNFα、IL-6 等多种促炎症细胞因子导致脓毒症、脓毒症休克，甚至死亡的发生。TL