单克隆抗体的制备
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简介
通过细胞融合技术（如 PEG 诱导法）将产生单一抗体的一种免疫动物 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种由单个克隆细胞产生的抗体分子称单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。经 HAT 选择培养基的选择，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得既能产生单一抗体、又能不断增殖的杂交瘤细胞系。这种细胞经过扩大培养，再接种于小鼠腹腔，即可在其腹水中得到高效价的单克隆抗体。
原理
单克隆抗体的制备原理是利用 HAT 选择培养基，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得既能产生单一抗体、又能不断增殖的杂交瘤细胞系。
来源：丁香实验
操作方法
材料 靶抗原：表达于细胞的抗原，或蛋白质、多肽 生理盐水 无血清培养基：仅用于细胞接种 弗 氏 完 全 佐 剂（ complete Freunds adjuvant， CFA)， Sigma 公司 实验动物：无 病 原 体 大 鼠 、小 鼠（推 荐 使 用 BALB/c小 鼠）或 仓 鼠（推荐使用Cytogen研究所的美洲仓鼠）
细胞融合与杂交瘤分选在 筛 选 检 测（辅助方案 1 ) 方案完善之前不应进行细胞融合。由于在细胞融合后可对目标单克隆抗体进行检测的次数是有限的，在细胞融合前必须检查条件培养液以排除筛选时可能出现的人为因素影响。 材 料 SP2/0-Agl4 骨 髓 瘤 细 胞 系（药物标记的非分泌型； ATCC) 添加10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L丙酮酸钠的 DME
杂交瘤培养上清的筛选分析附 加 材 料（其他材料见基本方案 2) 在 9 6 孔板中生长的杂交瘤（见基本方案 2) 添 加 10 mmol/L HEPES的 DMEM-2 0 完 全 培 养 基（附 录 1) 多道移液器和9 6 孔板，可选的 1.在倒置显微镜下观察生长的杂交瘤的孔数。确定是对所有孔进行细胞筛选还是只筛选长有杂交瘤的孔。 2.将生长的杂交瘤在C
杂交瘤的建系在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中 2 0 个最佳的候选孔。在检测这 2 0 个孔的培养上 清（见辅助方案1 ) 为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附 加 材 料（其他材 料 见 基 本 方 案 2) 生 长 的 杂 交 瘤（见基本方案 2) 克隆和扩增用
有限稀释克隆法附 加 材 料（其他材料见基本方案 2) 候 选 杂 交 瘤 系（见辅助方案 2) 克隆和扩增用培养基（见辅助方案 4) 微 孔 板 观 察 镜（由 Flow 实验室或 Dynatech 公司提供），可选的 1.重悬候选杂交瘤所在孔中的细胞（见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 4)，用血细胞计数器和台盼蓝 拒 染 试 验（附 录 3C) 对 一
克隆和扩增用培养基的制备附 加 材 料（其他材料见基本方案 2) 小鼠（以 BALB/c 小鼠为例）， 5 或 6 只 ， 4〜6 周龄，无 病 原 体（有可靠来源，避免支原体感染） 75 cm2 组织培养用细颈瓶 0.45 过滤装置 1.用颈椎脱臼法或二氧化碳窒息法处死 5 或 6 只 小 鼠（附 录 2 G; 避免使用麻醉剂）。无菌操作取出胸腺（附 录 2 H)
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