单克隆抗体制备中的免疫接种

 

材料

靶抗原：表达于细胞的抗原，或蛋白质、多肽

生理盐水

无血清培养基：仅用于细胞接种

弗 氏 完 全 佐 剂（ complete Freunds adjuvant， CFA)， Sigma 公司

实验动物：无 病 原 体 大 鼠 、小 鼠（推 荐 使 用 BALB/c小 鼠）或 仓 鼠（推荐使用Cytogen研究所的美洲仓鼠）

弗 氏 不 完 全 佐 剂（ incomplete Freunds adjuvant， IFA)， Sigma 公 司 ，可选用1〜2 ml玻 璃 注 射 器（有 Luer-Lok接头，已消毒）

三通管

IOOml烧杯

20 G 注射针头，已消毒

1.将2 X 10⁶〜5 X 10⁷ 个 细 胞 或 1〜50 ug 蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。如果免疫原为细胞，在接种前将细胞于无血清培养基中清洗3 次 。在 融 合 实 验（见基本 方 案 2 ) 前 至 少 3d 准备好已免疫接种的实验动物（足够用于几次的融合）。

2.使用1〜2 ml玻 璃 注 射 器（有 Luer-Lok接头）吸取抗原，连接三通管。

3.完全混匀CFA以打散结核分枝杆菌。用另一支玻璃注射器吸取与抗原液等量的CFA并连接装有抗原的注射器（图 1.2.1)。

4.将 抗 原 液 反 复 注 入 CFA 再 抽 出 直 至 稠 化 混 合 ，制 成 乳 状 液 。取 50m l冷水置于IOOml烧杯中。挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定。如果乳状液呈液滴状在水面聚集，则进入步骤5。如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。

5.将乳状液移入一个注射器，将另一个注射器和三通管移去。将 已 消 毒 的 20 G 注射针头安装于注射器上以封闭乳状液。

6.麻 醉 大 鼠（附 录 2D) ，或 固 定 小 鼠 或 仓 鼠（附 录 2 0 。腹腔内注射乳状液，剂量为(附录2E) : 大鼠每只0.5〜lml、小鼠每只小于0.2 ml、仓鼠每只0.2〜0.4 ml。将针头插入皮肤并于皮肤与腹膜壁间穿行一段距离后，再刺入腹膜腔。避免用力压迫注射器的活塞以免过度的压力使针头与注射器分离，造成乳状液的喷溅。在拔出针头前转动针头以减少渗出。

7.于 10〜14d 后以大约相同剂量的抗原二次免疫动物。如果计划在免疫3d 后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原或休眠期的完整细胞进行免疫。如果不立刻进行细胞融合，则 应 用 IFA (不含有结核分枝杆菌）乳化的抗原进行免疫，而不使用 CFA。

8 . 如果需要，可以于初次和二次免疫后的7〜IOd用 ELISA (单 元 1 . 1 ) 或免疫沉淀法(单元12. 2 ) 测 定 抗 体 滴 度（单 元 1.2)。