细胞融合与杂交瘤分选

材料

SP2/0-Agl4 骨髓瘤细胞系（药物标记的非分泌型； ATCC)

添加10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L丙酮酸钠的 DMEM-10和 DMEM-20 完全培养基（附录 1)

免疫的实验动物：小鼠、大鼠或仓鼠（在初次接种后 10〜14d 备用，见基本方案1)

5 0 % (m/V) PEG 溶液，无菌

DMEM完全培养基，未添加血清

氯化铵溶液：〇. 〇 2mol/L T ris. Cl， pH7.2(附录 I)/O .14mol/L NH4C1

添加 10 mmol/L HEPES、 lmmol/L 丙酮酸钠、 I X HAT 或 I X HT 的 DMEM-20完全培养基，取自 IOOX包装（以 Sigma公司产品为例），储存于 4°C一个月7 0 % (V A O 乙醇，仅用于容器消毒

175 cm2 组织培养用细颈瓶

倒置显微镜

400 ml和 600 ml烧杯（各 3 只）

IOOmm有盖培养皿

尖头镊和解剖剪

细网金属筛

50 ml塑料锥底离心管，无菌

Beckman离心机和TH-4转子或同等设备

9 6 孔平底微量滴定板

Im l和 IOml 移液管

1.细胞融合前一周，幵始在添加 HEPES 和丙酮酸钠的 DMEM-10 完全培养基中培养SP2/0-Ag1 4 骨髓瘤细胞系（融合用细胞）。在细胞融合操作前骨髓瘤细胞对于不同的实验动物应达到以下水平（每个 175 cm2 培养瓶含培养液IOOml) : 小鼠， IXlO⁸个细胞/瓶， 2 或 3 瓶；仓鼠， 2 X 10⁸ 个细胞/瓶， 3 或 4 瓶；大鼠， 5 X 10⁸〜IXlO⁹个细胞/瓶， 1 0 瓶。
两个小鼠或仓鼠，或一个大鼠的脾即可满足细胞融合的需要。

2.细胞融合前3d，进行二次免疫（见基本方案 1 ，步骤 7)。

3 . 细胞融合前ld，转移 SP2/0-Ag1 4 骨髓瘤细胞至新鲜的添加 HEPES 和丙酮酸钠的
DMEM-10 完全培养基中。
4.在细胞融合前，用倒置显微镜确定SP2/0-Agl4 骨髓瘤细胞生长良好（折光力强，未固缩），未污染（没有明显的细菌或真菌迹象），并且生长足量。如果骨髓瘤细胞不符合这些要求则暂不进行细胞融合。

5.将以下物品于37°C预热：
3 个 400 ml以及 3 个 600 ml烧杯，每个烧杯内盛IOOml水；

20 ml 无菌的未加血清的DMEM完全培养液；

5 ml无菌的 5 0 % PEG溶液。

6.处死二次免疫的实验动物（附录 2 G)。不要用麻醉法处死动物。对于小鼠，应用颈椎脱臼法，对于大鼠和仓鼠应用二氧化碳窒息法，取脾脏（附录 2 H)。

7.将脾脏移至预置了 IOml无菌的未加血清的DMEM完全培养液的IOOmm培养皿中。以下操作要求在层流罩中超净工作台完成。

8.使用尖头镊压碾或解剖剪将脾组织剪碎，移去组织碎片并通过细网金属筛进一步分离细胞，制成单细胞悬液。

9.将脾细胞悬液移至已消毒的50 ml塑料锥底离心管，并用无血清DMEM完全培养液加满离心管（不要使用含有蛋白质或HEPES 的培养液）。室温下， TH-4离心机中500 g 离心 5 min，弃上清。

10.在 5 ml氯化铵溶液中将细胞沉淀重悬以裂解红细胞。在室温下静置 5mirx，加入45 ml无血清 DMEM完全培养液，如步骤 9 进行离心。

11.加入 50m l无血清 DMEM完全培养液，将沉淀重悬，并再次离心。重复添加DMEM和离心 1 次，以完成2 次洗涤。

12.在洗涤脾细胞的同时，将 SP2/0-Agl4 骨髓瘤细胞移入 50 ml塑料锥底离心管。如步骤 9 进行离心，分离细胞。在 DMEM中重悬细胞，如步骤 1 1 洗涤骨髓瘤细胞3 次。

13.分别在 IOml无血清DMEM完全培养液中重悬脾细胞和骨髓瘤细胞。用细胞计数器和台盼蓝拒染试验对两种细胞悬液进行细胞计数和活力测定（附录 3 0 。此时两种细胞悬液应该都具有1 0 0 % 的细胞活力。

14.在细胞计数的基础上，以约 2. 5 X IO⁶ 个总细胞数 /m l计算培养细胞所需添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20 培养基的量。 37°C水浴预热此培养基。取 9 6 孔平底微量滴定板做好标签备用，每 IOml 细胞悬液需准备一个孔板。

15.将 SP2/0-Agl4 骨髓瘤细胞与脾细胞以I : I (V/V ) 的比例在 50m l塑料锥底离心管中混合。以无血清DMEM完全培养液加满离心管。室温下， 500 g 离心 5 min。

16.在进行细胞离心的同时，在层流罩中准备三个 600m l烧杯（步骤 5)，内盛 75〜100 ml 37°C温水，再将 3 个内盛 100 ml 37°C温水的 400 ml烧杯分别放入600 ml烧杯中，形成水浴环境。将预热的 5 0 % PEG溶液试管与无血清DMEM完全培养液试管（步骤 5 ) 分别放入 2 个 37°C水浴中。

17.吸取并丢弃混合细胞离心的上清部分（步骤 15)，并将离心管置于第三个水浴烧杯中。使用 Iml移液器向混合细胞沉淀中加入Iml预热的 5 0 % PEG，在 Imin内勻速逐滴缓慢加入，每加入一滴即用移液器轻轻搅匀细胞。滴加完成后轻轻搅匀lmin。

18.使用干净的移液管向混合细胞液中逐滴加入预热的无血清DMEM完全培养液，加入的同时轻轻搅匀：

Imin内匀速滴加 Iml DMEM;

Imin内匀速滴加Iml DMEM;

2〜3 min内匀速滴加7 ml DMEM (使用IOml移液管）。

注意，此时应有肉眼可见的细胞团漂浮。室温下， 500 g 离心 5 min。

19.在进行细胞离心的同时，将水浴烧杯重新加热到37°C ，并放入层流罩。将预热的添加 HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基放人水浴。

20.弃上清（步骤 18)，将试管放入水浴。用干净的IOml移液管将预热的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基用力吹入细胞沉淀。连续添加，直到将所有培养基加入步骤1 4 准备的培养基。如果培养基体积超过了 50 ml，小心地吸取多余量
转入其他无菌容器，如培养瓶。如果必要，可用移液管头压碎细胞团。此后，不需
继续保持细胞悬液于恒温水浴中。

小心地用IOml移液管吸取 IOml细胞悬液（不要使用粗糙的或重复使用的移液管）。
小心地在9 6 孔平底微量滴定板的每个孔中滴加2 滴（100〜125M) 细胞悬液。所有细胞悬液滴加完后，用一支干净的移液管除去过多的细胞悬液。 37°C过夜培养。为了最大程度地减少成纤维细胞的过度生长，可加入一个可选步骤：在移种到9 6 孔板之前，可以将完成融合的细胞悬液在培养瓶中培养过夜，以除去贴壁生长的成纤维细胞。

22.培养一天后，在倒置显微镜下检查细胞生长情况。移种了合适数量细胞的孔底部将出现成片的单层高活力细胞或细胞团。

23.用 IOml移液管在每个孔中滴加2 滴添加 HEPES、丙酮酸钠和 H A T 的 DMEM-20完全培养基混合液。每块孔板需更换不同的移液管头，并保证板盖不被互换，之后将孔板置于培养箱。

24.如果孔板发生污染，将其丢弃。或者，如果污染仅限制在1 或 2 个孔中，按以下步骤操作：用消毒的巴氏滴管吸取受污染的孔内容物，移入空培养瓶。用 7 0 % 乙醇漂洗这些孔，并用已消毒棉签擦拭。重复洗涤 2 次。用蘸有 7 0 % 乙醇的棉签擦拭周围。当有其他孔板在层流罩中时，不要打开受污染的孔板。

25.于培养的第2 、 3、 4、 5、 7、 9、 1 1 天，用已消毒的小号巴氏滴管吸取每个孔的一半培养液，移入空培养瓶。操作时将滴管保持451K斜，贴近培养上清的表面吸取。每个孔板需使用不同的滴管。加入添加 HEPES、丙酮酸钠和 H A T 的 DMEM-20完全培养基混合液（步骤 23)，放回孵箱。如果在第 2 天和第 3 天没有发现明显的细胞死亡迹象，用加有 H A T 的培养液培养部分原骨髓瘤细胞，以检测两者的质量。

26.培养 4d 后，根据孔中的实际细胞数量、融合效率和杂交瘤的外观及生长情况来决定是否更换培养基。避免孔中液体变成黄色（酸性）并持续 I d 以上。即使不需要更换培养液也应每天检查孔板，并在出现酸性迹象前更换培养液。

27.培养第 1 4 天，改用添加HEPES、丙酮酸钠和H T 的 DMEM-20 完全培养液培养细胞，放回培养箱培养。

28.培养第 1 5 天直至最后，改用不添加 H A T 或 H T 的含有 HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20 完全培养液。当大多数孔内细胞生长到占孔底面积的1 0 % 〜2 5 % 时，可以进行杂交瘤筛选。对于生长特别稠密的孔，可以在换液后2d，培养液变黄时进行细胞筛选（一般情况下，小鼠-小鼠细胞或大鼠-小鼠细胞融合后需10〜14d，仓鼠-小鼠细胞融合后需14〜21d; 见辅助方案1)。

如果在筛选检测中需用3 H-胸腺嘧啶核苷摄入试验（附录 3E) ，至少需要更换3或 4 次不添加 H A T 或 H T 的含有 HEPES和丙酮酸钠的 DMEM- 20完全培养液，稀释残留的胸腺嘧啶核苷以不影响之后的标记。

来源：丁香实验

细胞融合与杂交瘤分选

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