杂交瘤的建系

 

在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中 2 0 个最佳的候选孔。在检测这 2 0 个孔的培养上 清（见辅助方案1 ) 为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。

附 加 材 料（其他材 料 见 基 本 方 案 2)

生 长 的 杂 交 瘤（见基本方案 2)

克隆和扩增用培养基（见辅助方案 4)

2 4 孔板

4 ml 有盖试管，无菌

1.当 9 6 孔板中生长的杂交瘤长到 2 5 % 〜5 0 % 汇 合 时（主要孔），用 无 菌 的 移 液 器（调节 为 100ul 的微量移液器）将主要孔中的细胞重悬，并将孔中全部内容物转入 2 4 孔板的一个孔，保证有足量的细胞在此扩增孔中扩增。若是从一个长有成纤维细胞的孔中转移细胞，应该尽早进行转移操作，以免成纤维细胞过度生长，并且操作时切忌 刮 到 孔 底（这样做会松动成纤维细胞）。

2.用Iml移液器在主要孔中滴入 3 滴 添 加 10 mmol/L HEPES和lmmol/L 丙酮酸钠的DMEM-20完 全 培 养 液（见基本方案 2 , 步 骤 23)，放 回 CO2 培养箱培养。

3.用干净的移液器取 1〜1.5 ml 用于克隆和扩增的培养基加入2 4 孔 板 ， CO2 培养箱培养 2〜3d。主要孔与扩增孔要用不同的移液器从不同的试剂瓶中取用培养基。

4.当 2 4 孔板中的细胞长到 2 5 % 〜5 0 % 汇 合 时（2〜3d)，用有限稀释技术进行克隆操作(见辅助方案 3)。而当主要孔中的细胞长到 2 5 % 〜5 0 % 汇合时，必要时可重复步骤1〜30

5.完成有限稀释操作之后，将 2 4 孔板中多余的细胞移入 4 ml无菌有盖试管中。用添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液继续培养 2 4 孔板中的细胞。

6.将 前 述 4m l 管于室温， 500 g 离 心 5 min。将上清保留以备进一步抗体鉴定或作为对照 。冻 存 细 胞 沉 淀（附 录 3B)。如果已确定建立了稳定的细胞克隆，那么细胞建系就完成了，将其冻存，并确保可被顺利复苏。

7.如果有限稀释操作不能培养出有抗体分泌活性的细胞系，则复苏那些之前从 2 4 孔板中分离的细胞。将其重新在 2 4 孔板中培养，过 夜 ，并用这些细胞重新建立有限稀释孔板。将其冻存并妥善保存。