细胞稳转建系后再转染遇到的问题

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总有一种转染方法适合你

问：细胞稳定转染建系后，转染的质粒细胞内本身有较高表达，我的质粒是点突变 的质粒，我做的是稳定转染，按理论稳定建系后不应该对细胞增值有影响的。

根据实验设计，我往已经稳定建系的细胞中，再瞬时转染了带报告基因的另一种质粒 ，同时往野生型即没有转染任何质粒的细胞中也同时转入了相应报告基因质粒，两者相比稳定转染的细胞系转染效率与野生型相比明显低了几百倍。报告基因的读值一个为20几万，而稳定建系的只有几万，相差太大了。

答：

质粒的复制体系竞争是指的原核复制过程中具有相同复制起始位点和利用同一复制体系的质粒互相竞争，即分子 克隆上讲过的质粒不相容原理。但是质粒在真核细胞内没有复制过程，也就没有这一现象。所以应该不是这个原因。

我理解也是一种竞争性抑制，但是是和质粒的表达有关。由于真核质粒多采用CMV等强启动子，所以表达水平很高，对胞内的转录资源是一种显著占用。这也就是高水平表达的稳转细胞株反而不易存活的原因--外源蛋白过度表达占用了正常功能蛋白表达的资源。

因此，稳转后再转染另一质粒，应该很难获得和初次转染一样的高表达效率。

同时，相同真核启动子之间是否也有直接竞争关系?这个也有可能的。我们看到成熟的商品化载体在同时表达两种蛋白产物时(如EGFP和neo)，均有意采用不同启动子和不同的转录终止区。从pEGFP-N1的载体图可以看出。这说明这种竞争很可能是存在的而且应该避免。楼主先后转染的质粒可能也是同一启动子启动目的基因的，可以尝试第二种质粒换一个启动子试试，例如TK(胸苷激酶)启动子启动的pGL3-promotor