质粒转染细胞

指利用不同的载体物质携带质粒 DNA 通过直接穿膜或膜融合的方法将外源 DNA 分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。

研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产。

【材料试剂】待转染的细胞、胎牛血清、基础培养基 、胰酶、Lipofectamine 2000 、Opti-MEM

【仪器用品】荧光显微镜、CO₂ 培养箱、倒置显微镜、离心机、生物安全柜

1. 准备目的细胞

（1） 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37 ℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。

（2） 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。

（3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 完全培养基的 6 cm 培养皿中，轻轻晃匀后置于 37 ℃、5% CO₂ 培养箱。

（4） 更换一次培养液后再继续培养。

（5） 使用细胞密度达 90% 的细胞进行传代培养。胰酶消化后使用完全培养基制成细胞悬液并分至两个新的 6 cm 培养皿中，补足完全培养基至 4 mL，继续培养。

1. 目的细胞质粒转染

（1） 对数生长期的细胞制成细胞悬液，计数，接种于 24-well 培养板中（细胞数约为 2 × 10⁴，具体根据细胞形态大小而定），37 ℃、5% CO₂ 培养箱培养至细胞融合度达到约 80%。

（2） 根据细胞转染预实验和 invitrogen lipofectamine 2000 转染试剂使用说明书设计，加入适宜量的质粒和转染试剂。

（3） 转染前更换为新鲜的完全培养基。转染 24~48 h 后观察质粒上荧光标记基因的表达情况，荧光率应大于 80%表示转染成功。拍完荧光后补加 500 µL 正常培养基，待长满后收集细胞用于 RNA 提取或蛋白质检测。

（1）细胞密度：细胞铺板与转染最好当天进行，一般来说，当细胞密度达到 70%～90% 时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。

（2）细胞状态：为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。传代尽量保证细胞分布均匀、密度合适。其次，尽量选择无支原体污染的细胞。可以使用支原体检测试剂盒进行检测，确保无支原体污染。

（3）DNA 纯度：在制备高纯度 DNA 时，还需要对 DNA 进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率。

（4）质粒的构建：启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无影响，但是对基因表达水平影响较大。

（1）质粒转染效率低：应从细胞状态、DNA 量以及质量等方面入手改进，可参考注意事项中的要点来改善细胞状态，提高 DNA 的浓度和纯度；

（2）细胞死亡率高：细胞状态差或者数量少，以及转染的 DNA 量太高均会导致细胞死亡率高。