【共享】单克隆抗体的制备
丁香园论坛
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抗海带多糖单克隆抗体的制备
一 实验目的
利用单克隆抗体的制备原理和技术，将纯化的重组钙网蛋白片段（CRT39-272）和海带多糖（laminarin）偶联作为抗原免疫小鼠，增强海带多糖的免疫原性，制备抗海带多糖（LAM）的单克隆抗体。
二 实验原理
骨髓瘤细胞在体外培养时能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养液[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养液中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养液中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养液中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
本实验即利用这一原理，以海带多糖作为抗原制备相应的单克隆抗体。
三 实验基本流程
全长海带多糖免疫Balb/C小鼠→测定血清中抗体的效价→取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合→HAT选择培养→筛选阳性杂交瘤→克隆化培养→选择生长良好、高分泌特异性抗体的克隆扩大培养→杂交瘤细胞的冻存和复苏→单克隆抗体的制备和纯化→单克隆抗体的特性鉴定（特异性鉴定、效价测定、识别抗原表位、生物学活性、亲和力以及亚类测定等）
四 实验步骤
（一）小鼠的免疫
选择纯种BALB/C雌性小鼠（10只）进行免疫，初次免疫时以每只小鼠100μgLAM（共100μl，为LAM与CRT39-272的偶联物，对应的蛋白含量为20μg）进行免疫，后续免疫均为50μgLAM。具体流程为：
初次免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+CFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着100μgLAM，20μg CRT39-272）， 7天后眼眶采血测其效价
↓两周后
第二次免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+IFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着50μgLAM，10μg CRT39-272）， 7天后眼眶采血测其效价
↓两周后
第三次免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+IFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着50μgLAM，10μg CRT39-272）， 7天后眼眶采血测其效价
↓两周后
激发免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+IFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着50μgLAM，10μg CRT39-272）
↓3天后
取脾融合
（二）细胞融合
1．细胞融合前准备
（1）骨髓瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞应和免疫动物应属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于杂交瘤产生大量McAb，常用的骨髓瘤细胞为Sp2/0。制备方法如下：
取对数生长骨髓瘤细胞离心，弃上清
↓
用无血清培养液洗2次，离心后再重悬
↓
计数，取得4×107细胞备用
（2）制备免疫脾细胞
激发免疫3天后将小鼠摘除眼球法处死小鼠，收集血样
↓
无菌条件下取出脾脏，置于盛有不完全培养液的平皿中，去除结缔组织
↓
将脾脏转移到另一盛有不完全培养液的平皿中，放在200目不锈钢筛网上，用注射器针芯将脾脏研碎
↓
收集细胞悬液于50 ml离心管中，1200 rpm离心5min，弃上清
↓
用培养液将细胞洗2次，每次洗后离心且去上清
↓
用不完全培养液重悬细胞，计数
↓
脾细胞（免疫后1~2×108细胞/脾）的悬液备用
（3）制备饲养细胞（制取脾细胞悬液，细胞融合前1-2天）
BALB/C小鼠（6～10周）
↓
摘除眼球法处死小鼠，浸泡在75%酒精内，3～5min
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
取脾脏，制备脾细胞悬液
↓
用含HAT 、20% FBS的DMEM培养液重悬细胞，调整细胞数至1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37℃，5%CO2培养箱培养
（4）细胞融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇的（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略微松动。
②60s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量1500）溶液，边加边轻微摇动，37℃水浴作用90s。
③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④800rpm离心10min。
⑤弃上清，用含20%胎牛血清的HAT选择培养液重悬。
⑥根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液至200μl/每孔的用量。
⑦将上述融合后的悬浮细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。
⑧将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
1．HAT选择杂交瘤细胞
脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在有HAT选择培养液时可以生长繁殖。
每3天半量换液，HAT选择培养液培养2周后换用HT培养液， 2周后改用DMEM完全培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时（1/3低倍镜视野），即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在细胞融合后第一天开始对细胞进行仔细的观察，记录细胞的生长状态、每孔中杂交细胞瘤的个数、块数、培养液有无污染和饲养细胞等的情况。
2．单克隆抗体的鉴定
（1）单抗的特异性鉴定
可以采用如下方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。
（2）单克隆抗体的类型、亚型的测定
试纸条法检测单抗的Ig类型和亚型。
（3）单抗的效价测定
采用ELISA测定，培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106，单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
（4）必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
（四）杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法，本实验中用的是有限稀释法。
（1）克隆前1天制备饲养细胞（同细胞融合前准备）。
（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吸出，计数细胞浓度。
（3）调整细胞为0.5, 1, 2,5个细胞/孔。
（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2培养箱中 。
（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次，仔细观察各孔中细胞的生长状况，并做好记录。
（6）待细胞克隆长满1/4～1/3孔时，吸取上清按照已经建立的阳性克隆的检测方法再做分析，当抗体的阳性孔检出率为100%时即可视为单克隆，预计得进行2～3次的重复克隆，并及时检测抗体活性。
（7）选择生长良好、抗体分泌量高的杂交瘤细胞于96孔培养板中继续扩大培养并及时用液氮冻存。
（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏
1．杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的，因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。
细胞冻存液：50%胎牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速，冻存时从室温立即降至0℃后放入-80℃超低温冰箱，次日转入液氮中。冻存液中血清含量不应低于20%，血清浓度越高，冷冻效果越好，一只冻存管可冻存5～10×106个细胞，冻存液的体积为1ml。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和所分泌抗体的稳定性。
2．细胞复苏方法
将冻存的细胞从液氮中小心取出，放37℃水浴中解冻，当冰块接近于完全融化时，在无菌条件下将细胞悬液转移到预冷的含血清的完全培养液中，轻轻混匀，1000rpm离心5min，除去冻存液，再重新悬浮于新鲜的培养液中，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
（六）单克隆抗体的大量生产
将单抗细胞株注射入提前一周注射降植烷的Balb/C小鼠的腹腔中（5x105），每天观察小鼠的状况，当小鼠腹水涨到一定程度后杀鼠获取含有单抗的腹水，并从腹水中纯化相应单抗。
（七）单克隆抗体的鉴定
对制备的单克隆抗体进行系统的鉴定是十分必要的，应做以下几点的鉴定：
1．抗体特异性的鉴定
除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，即用ELISA法。
2．McAb的Ig类与亚类的鉴定
在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。
3．抗体效价的测定
用ELISA（间接法）来检测单克隆抗体的效价。
4．McAb中和活性的鉴定
用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。
5．McAb识别抗原表位的鉴定
用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别表位是否相同。
6．McAb亲合力的鉴定
用ELISA来确定McAb与LAM结合的亲合力。
（八）应用及意义
注：所用相关实验动物和试剂等信息如下所示：
Balb/C雌性小鼠（6~8周），南京鹏晟；
CFA ,Sigma ，F5881-10x10ML；
IFA ，Sigma ，F5506-10x10ML；
HAT , Sigma ，H0137-10VL；
HT , Sigma， H0262-10VL；
Laminarin ，Sigma ，L9634；
CRT/39-272 ,自己纯化所得；
PEG ，罗氏 ，RD10783641001；
降植烷 ，Sigma ，P2820；
DMSO ，Sigma ，D2650:；
DMEM ，HyClone ，SH30021.01B；
FBS ，HyClone ，SH30084.03；
SP2/0 ，本实验室细胞库。
一 实验目的
利用单克隆抗体的制备原理和技术，将纯化的重组钙网蛋白片段（CRT39-272）和海带多糖（laminarin）偶联作为抗原免疫小鼠，增强海带多糖的免疫原性，制备抗海带多糖（LAM）的单克隆抗体。
二 实验原理
骨髓瘤细胞在体外培养时能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养液[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养液中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养液中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养液中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
本实验即利用这一原理，以海带多糖作为抗原制备相应的单克隆抗体。
三 实验基本流程
全长海带多糖免疫Balb/C小鼠→测定血清中抗体的效价→取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合→HAT选择培养→筛选阳性杂交瘤→克隆化培养→选择生长良好、高分泌特异性抗体的克隆扩大培养→杂交瘤细胞的冻存和复苏→单克隆抗体的制备和纯化→单克隆抗体的特性鉴定（特异性鉴定、效价测定、识别抗原表位、生物学活性、亲和力以及亚类测定等）
四 实验步骤
（一）小鼠的免疫
选择纯种BALB/C雌性小鼠（10只）进行免疫，初次免疫时以每只小鼠100μgLAM（共100μl，为LAM与CRT39-272的偶联物，对应的蛋白含量为20μg）进行免疫，后续免疫均为50μgLAM。具体流程为：
初次免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+CFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着100μgLAM，20μg CRT39-272）， 7天后眼眶采血测其效价
↓两周后
第二次免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+IFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着50μgLAM，10μg CRT39-272）， 7天后眼眶采血测其效价
↓两周后
第三次免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+IFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着50μgLAM，10μg CRT39-272）， 7天后眼眶采血测其效价
↓两周后
激发免疫 LAM-CRT39-272皮下免疫小鼠（+IFA，V:V=1:1，100?l/mouse，对应着50μgLAM，10μg CRT39-272）
↓3天后
取脾融合
（二）细胞融合
1．细胞融合前准备
（1）骨髓瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞应和免疫动物应属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于杂交瘤产生大量McAb，常用的骨髓瘤细胞为Sp2/0。制备方法如下：
取对数生长骨髓瘤细胞离心，弃上清
↓
用无血清培养液洗2次，离心后再重悬
↓
计数，取得4×107细胞备用
（2）制备免疫脾细胞
激发免疫3天后将小鼠摘除眼球法处死小鼠，收集血样
↓
无菌条件下取出脾脏，置于盛有不完全培养液的平皿中，去除结缔组织
↓
将脾脏转移到另一盛有不完全培养液的平皿中，放在200目不锈钢筛网上，用注射器针芯将脾脏研碎
↓
收集细胞悬液于50 ml离心管中，1200 rpm离心5min，弃上清
↓
用培养液将细胞洗2次，每次洗后离心且去上清
↓
用不完全培养液重悬细胞，计数
↓
脾细胞（免疫后1~2×108细胞/脾）的悬液备用
（3）制备饲养细胞（制取脾细胞悬液，细胞融合前1-2天）
BALB/C小鼠（6～10周）
↓
摘除眼球法处死小鼠，浸泡在75%酒精内，3～5min
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
取脾脏，制备脾细胞悬液
↓
用含HAT 、20% FBS的DMEM培养液重悬细胞，调整细胞数至1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37℃，5%CO2培养箱培养
（4）细胞融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇的（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略微松动。
②60s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量1500）溶液，边加边轻微摇动，37℃水浴作用90s。
③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④800rpm离心10min。
⑤弃上清，用含20%胎牛血清的HAT选择培养液重悬。
⑥根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液至200μl/每孔的用量。
⑦将上述融合后的悬浮细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。
⑧将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
1．HAT选择杂交瘤细胞
脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在有HAT选择培养液时可以生长繁殖。
每3天半量换液，HAT选择培养液培养2周后换用HT培养液， 2周后改用DMEM完全培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时（1/3低倍镜视野），即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在细胞融合后第一天开始对细胞进行仔细的观察，记录细胞的生长状态、每孔中杂交细胞瘤的个数、块数、培养液有无污染和饲养细胞等的情况。
2．单克隆抗体的鉴定
（1）单抗的特异性鉴定
可以采用如下方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。
（2）单克隆抗体的类型、亚型的测定
试纸条法检测单抗的Ig类型和亚型。
（3）单抗的效价测定
采用ELISA测定，培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106，单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
（4）必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
（四）杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法，本实验中用的是有限稀释法。
（1）克隆前1天制备饲养细胞（同细胞融合前准备）。
（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吸出，计数细胞浓度。
（3）调整细胞为0.5, 1, 2,5个细胞/孔。
（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2培养箱中 。
（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次，仔细观察各孔中细胞的生长状况，并做好记录。
（6）待细胞克隆长满1/4～1/3孔时，吸取上清按照已经建立的阳性克隆的检测方法再做分析，当抗体的阳性孔检出率为100%时即可视为单克隆，预计得进行2～3次的重复克隆，并及时检测抗体活性。
（7）选择生长良好、抗体分泌量高的杂交瘤细胞于96孔培养板中继续扩大培养并及时用液氮冻存。
（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏
1．杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的，因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。
细胞冻存液：50%胎牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速，冻存时从室温立即降至0℃后放入-80℃超低温冰箱，次日转入液氮中。冻存液中血清含量不应低于20%，血清浓度越高，冷冻效果越好，一只冻存管可冻存5～10×106个细胞，冻存液的体积为1ml。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和所分泌抗体的稳定性。
2．细胞复苏方法
将冻存的细胞从液氮中小心取出，放37℃水浴中解冻，当冰块接近于完全融化时，在无菌条件下将细胞悬液转移到预冷的含血清的完全培养液中，轻轻混匀，1000rpm离心5min，除去冻存液，再重新悬浮于新鲜的培养液中，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
（六）单克隆抗体的大量生产
将单抗细胞株注射入提前一周注射降植烷的Balb/C小鼠的腹腔中（5x105），每天观察小鼠的状况，当小鼠腹水涨到一定程度后杀鼠获取含有单抗的腹水，并从腹水中纯化相应单抗。
（七）单克隆抗体的鉴定
对制备的单克隆抗体进行系统的鉴定是十分必要的，应做以下几点的鉴定：
1．抗体特异性的鉴定
除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，即用ELISA法。
2．McAb的Ig类与亚类的鉴定
在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。
3．抗体效价的测定
用ELISA（间接法）来检测单克隆抗体的效价。
4．McAb中和活性的鉴定
用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。
5．McAb识别抗原表位的鉴定
用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别表位是否相同。
6．McAb亲合力的鉴定
用ELISA来确定McAb与LAM结合的亲合力。
（八）应用及意义
注：所用相关实验动物和试剂等信息如下所示：
Balb/C雌性小鼠（6~8周），南京鹏晟；
CFA ,Sigma ，F5881-10x10ML；
IFA ，Sigma ，F5506-10x10ML；
HAT , Sigma ，H0137-10VL；
HT , Sigma， H0262-10VL；
Laminarin ，Sigma ，L9634；
CRT/39-272 ,自己纯化所得；
PEG ，罗氏 ，RD10783641001；
降植烷 ，Sigma ，P2820；
DMSO ，Sigma ，D2650:；
DMEM ，HyClone ，SH30021.01B；
FBS ，HyClone ，SH30084.03；
SP2/0 ，本实验室细胞库。
