方案27.11 单克隆抗体的制备
最新修订时间：
原理
使用聚二乙醇（PEG ) 将抗原免疫过的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（P3. 653 )进行融合。用 HAT 选择性培养基筛选杂合的克隆株（杂交瘤细胞）。融合后 10~14 天用 ELISA 对上清液进行筛査（ELISA 筛査方法必须在融合前就已掌握），然后对理想的杂交瘤细胞加以扩增、冷冻和亚克隆，以确保其单克隆特性。
材料与仪器
小鼠 P3.653骨髓瘤细胞 抗原 D-PBSA SFM PEG
佐剂 TCD(T细胞耗竭）缓冲液 抗小鼠Thyl.2抗体 使用液 家兔补体 HAT储存液 HAT培养基 SCM 8-氮杂鸟嘌呤备用液 MEM HT储存液 HT培养基 台盼蓝
注射器 组织分离器 培养皿 离心管 多孔培养瓶 Nalgene试剂瓶 吸头 盛液池 多道加样器 倒置相差显微镜 Unopette 微收集系统 血细胞计数仪
佐剂 TCD(T细胞耗竭）缓冲液 抗小鼠Thyl.2抗体 使用液 家兔补体 HAT储存液 HAT培养基 SCM 8-氮杂鸟嘌呤备用液 MEM HT储存液 HT培养基 台盼蓝
注射器 组织分离器 培养皿 离心管 多孔培养瓶 Nalgene试剂瓶 吸头 盛液池 多道加样器 倒置相差显微镜 Unopette 微收集系统 血细胞计数仪
步骤
免疫动物
1. 在进行初次注射前（0 天），先采小鼠血，检测血清背景抗原的反应性。
2. 使用弗氏佐剂（（明矶或完全/不完全弗氏佐剂；Sigma ) : 有关这些佐剂及其他佐剂的详述可见 Vogel 及 Powell (1995 )的评述）乳化抗原（最佳剂量为125 μg/小鼠；小剂量抗原可与锁眼型血蓝蛋白素（KLH，Sigma ) 进行耦联，以增加其抗原性），或按 1 : 10 与明矾混合旋振抗原，经腹腔将抗原分 3 次接种（免疫）A /J 或 Balb/c 小鼠，接种剂量如下：
3. 在第 35 天时采小鼠血，用 ELISA 法测定血清中抗体的效价。
4. 将血清顺序稀释至1 : 4、1 : 30、直至 1 : 30720。
5. 选择含最高效价抗原的小鼠，以备融合使用。
6. 在融合前3 天，对相应动物加强免疫，即静脉注射 10 μg 或者腹腔注射 25 μg 抗原。
骨髓瘤细胞
1. 为了便于操作，选择周一给予小鼠加强免疫，周四即可进行融合。
2. 用 MEM+ 10 % 胎牛血清 + 氮杂鸟嘌呤培养基培养P3. 653 骨髓瘤细胞（此种背髓瘤细胞系不分泌免疫球蛋白，非常适用于融合反应（P 3. 653细胞 ATCC 有售））。
3. 融合前三天，每天将 P3. 653 稀释至 3.5X105个/ml。
T 细胞耗竭（depletion)
1. 自血清效价稳定的小鼠采血后，引颈处死。
2. 无菌操作下取出脾脏，放入一个盛有 5 ml 灭菌 D-PBSA 的培养皿中。
3. 用两个 1 ml 注射器所带的 23G 针头小心地拨碎脾脏，不要用力过猛，以免夹带出大量的成纤维细胞。
4. 将细胞移至一个 15 ml 的锥形管中，使凝块沉降。
5. 取未聚集成块的脾细胞，移至一个 50 ml 的锥形管中，用 Unopette 按1:100 稀释，血球计数板计数细胞。
6. 200 g 离心 8 min。
7. 将细胞沉淀于 0.84% NH4Cl ( 约需 10 ml/脾脏）中制成悬液，置 4 ℃ 15 min，以溶解红细胞。
8. 在细胞悬液表层铺加 14 ml 马血清，然后 450 g 离心 8 min。
9. 在 50 ml TCD ( T 细胞耗竭）缓冲液（（Hank’s液）平衡盐溶液+10 mmol/L HEPES+0.3 % BSA）中将沉淀再次悬浮，以 200 g 离心 8 min。
10. T 细胞的衰竭。用含抗-Thy 1.2 溶液（在 TCD 缓冲液中加 1 : 500 的抗-Thy 1. 2 , 过滤除菌）将上述细胞沉淀制成终浓度为 1X 107 个/m l 的悬液。
11. 4℃ 静置 45 min，然后 200 g 离心 8 min。
12. 将沉淀以稀释后的家兔补体液制成悬液。
13. 37℃ 培养 45 min。然后以 200 g 离心 8 min。
14. 通过台盼蓝染色计数细胞（见方案 22. 1)。B. 细胞回收率应为 30 % ~50 % 。
融合
1. 将骨髓瘤细胞和脾细胞在一个 50 ml 离心管中混合次融合所需的脾细胞最多为 1.2X108 个。将脾细胞与 P3. 653骨髓瘤细胞以 4 : 1 比例混合；即每次融合的 P3. 653 细胞最多为 3X107 个。
2. 细胞悬液以 200 g 离心 8 min。
3. 轻轻弹击，将沉淀物充分打散，加入 1 ml PEG（PEG ( 聚乙二醇）：于 56°C 水浴中将 10.5 ml PEG 1450 (Sigma) 溶解，加入 19.5 ml 无菌温热的 MEM ( pH 为 8.3~8.7) ；充分混合；拧松瓶盖，融合前平衡 5~7 天），融合时间至少 15 s。
4. 轻柔地振荡混匀液 75 s ，悬浮细胞。
5. 加入 1 ml SFM（MEM 置于室温平衡，松开瓶盖使培养基中的 CO2 完全释出；pH 需为碱性），至少 15 s , 轻摇振荡 45 s。
6. 加入 2 ml SFM，至少 30 s , 轻摇振荡 90 s。
7. 加入 4 ml HAT 培养基（基础培养基，如 MEM 或 RPMI，加 10% FBS 和 20 % 脾细胞条件培养基，与 HAT 储存液（（10 mmol/L 次黄嘌呤，40 μmol/L 氨基蝶呤，1.6 mmol/L胸苷）：取 1.36 g 次黄嘌呤、729 μl 氨基蝶呤（取自25 mg/ml 储存液）、0.387g 胸背以及 0.022 g 甘氨酸，溶于4 ml 的 5 mol/L NaOH +26 ml 超纯水中。用超纯水补至1 L，过滤除菌）混合（稀释到终末1:100 )），至少 30 s，轻摇振荡 90 s。
8. 最后，加入 8 ml HAT 培养基，至少 30 s，轻摇振荡 90 s。
9. 将上述 16 ml 混合液移入一个无菌的 Nalgene 瓶中，瓶中预盛 HAT 培养基 ( 如果以最大量融合细胞，则需预盛 125 ml HAT 培养液，换言之如果该 16 ml 细胞悬液中含有上述第 1 步中提到的最大融合细胞密度的话（即 1. 5X108 个），需要补加 125 ml HAT 培养基，则瓶中总体积为 141 ml，加上第 10 步离心洗涤所需培养基，终体积为 150 ml，细胞浓度为 1X106/ml)。
10. 将 50 ml 离心管用 9 ml HAT 淋洗后，移到瓶中。
11. 将瓶内各成分混匀，将细胞悬液移至消毒的多道盛液池。
12. 使用 12 道加样器，按 200 μl/孔的量将细胞接种到 96 孔培养皿上，每孔的细胞总数为 2X105/ml。
杂交瘤的筛选
1. 融合 5 天后换液，将原培养基尽量吸去，重新加入新鲜 HAT 培养基（150~200 μl/孔）以维持细胞生长。
2. 每周换液两次。
3. 融合后两周，通过 ELISA 法筛査阳性杂交克隆。
4. 再经 48 h ，重新进行 ELISA 检测，以确定该阳性克隆。
5. 在 96 孔板上划出两个孔，将抗体分泌最高的（阳性）杂交瘤细胞克隆移入这两个孔内，加含 10% FBS 及 HT 的培养基培养。
6. 重新检测细胞。在一个 24 孔板上扩增培养阳性杂交瘤细胞，在撤去 HT 培养基（用基础培养基将 100X HT 储存液（取 0.408 g 次黄嘌呤、0.1161 g 胸苷和 0.0067g 甘氨酸，溶于2 ml 5 mol/L NaOH + 8 ml 超纯水中，用超纯水补液至 300 ml。过滤除菌）稀释（同上述H A T 培养基））时，取 2 ml 培养上清进行筛査。此步骤中，应取足量的上清，进行多次重复测定，以确定该抗体是所免疫抗原的特异产物。
7. 于 24 孔培养板分出 4 孔，进行杂交瘤细胞的扩增，并冷冻保存细胞（见方案 20.1)。
8. 于一个 75 cm2 培养瓶中再次扩大培养杂交瘤细胞，之后再次冷冻保存。
1. 在进行初次注射前（0 天），先采小鼠血，检测血清背景抗原的反应性。
2. 使用弗氏佐剂（（明矶或完全/不完全弗氏佐剂；Sigma ) : 有关这些佐剂及其他佐剂的详述可见 Vogel 及 Powell (1995 )的评述）乳化抗原（最佳剂量为125 μg/小鼠；小剂量抗原可与锁眼型血蓝蛋白素（KLH，Sigma ) 进行耦联，以增加其抗原性），或按 1 : 10 与明矾混合旋振抗原，经腹腔将抗原分 3 次接种（免疫）A /J 或 Balb/c 小鼠，接种剂量如下：
3. 在第 35 天时采小鼠血，用 ELISA 法测定血清中抗体的效价。
4. 将血清顺序稀释至1 : 4、1 : 30、直至 1 : 30720。
5. 选择含最高效价抗原的小鼠，以备融合使用。
6. 在融合前3 天，对相应动物加强免疫，即静脉注射 10 μg 或者腹腔注射 25 μg 抗原。
骨髓瘤细胞
1. 为了便于操作，选择周一给予小鼠加强免疫，周四即可进行融合。
2. 用 MEM+ 10 % 胎牛血清 + 氮杂鸟嘌呤培养基培养P3. 653 骨髓瘤细胞（此种背髓瘤细胞系不分泌免疫球蛋白，非常适用于融合反应（P 3. 653细胞 ATCC 有售））。
3. 融合前三天，每天将 P3. 653 稀释至 3.5X105个/ml。
T 细胞耗竭（depletion)
1. 自血清效价稳定的小鼠采血后，引颈处死。
2. 无菌操作下取出脾脏，放入一个盛有 5 ml 灭菌 D-PBSA 的培养皿中。
3. 用两个 1 ml 注射器所带的 23G 针头小心地拨碎脾脏，不要用力过猛，以免夹带出大量的成纤维细胞。
4. 将细胞移至一个 15 ml 的锥形管中，使凝块沉降。
5. 取未聚集成块的脾细胞，移至一个 50 ml 的锥形管中，用 Unopette 按1:100 稀释，血球计数板计数细胞。
6. 200 g 离心 8 min。
7. 将细胞沉淀于 0.84% NH4Cl ( 约需 10 ml/脾脏）中制成悬液，置 4 ℃ 15 min，以溶解红细胞。
8. 在细胞悬液表层铺加 14 ml 马血清，然后 450 g 离心 8 min。
9. 在 50 ml TCD ( T 细胞耗竭）缓冲液（（Hank’s液）平衡盐溶液+10 mmol/L HEPES+0.3 % BSA）中将沉淀再次悬浮，以 200 g 离心 8 min。
10. T 细胞的衰竭。用含抗-Thy 1.2 溶液（在 TCD 缓冲液中加 1 : 500 的抗-Thy 1. 2 , 过滤除菌）将上述细胞沉淀制成终浓度为 1X 107 个/m l 的悬液。
11. 4℃ 静置 45 min，然后 200 g 离心 8 min。
12. 将沉淀以稀释后的家兔补体液制成悬液。
13. 37℃ 培养 45 min。然后以 200 g 离心 8 min。
14. 通过台盼蓝染色计数细胞（见方案 22. 1)。B. 细胞回收率应为 30 % ~50 % 。
融合
1. 将骨髓瘤细胞和脾细胞在一个 50 ml 离心管中混合次融合所需的脾细胞最多为 1.2X108 个。将脾细胞与 P3. 653骨髓瘤细胞以 4 : 1 比例混合；即每次融合的 P3. 653 细胞最多为 3X107 个。
2. 细胞悬液以 200 g 离心 8 min。
3. 轻轻弹击，将沉淀物充分打散，加入 1 ml PEG（PEG ( 聚乙二醇）：于 56°C 水浴中将 10.5 ml PEG 1450 (Sigma) 溶解，加入 19.5 ml 无菌温热的 MEM ( pH 为 8.3~8.7) ；充分混合；拧松瓶盖，融合前平衡 5~7 天），融合时间至少 15 s。
4. 轻柔地振荡混匀液 75 s ，悬浮细胞。
5. 加入 1 ml SFM（MEM 置于室温平衡，松开瓶盖使培养基中的 CO2 完全释出；pH 需为碱性），至少 15 s , 轻摇振荡 45 s。
6. 加入 2 ml SFM，至少 30 s , 轻摇振荡 90 s。
7. 加入 4 ml HAT 培养基（基础培养基，如 MEM 或 RPMI，加 10% FBS 和 20 % 脾细胞条件培养基，与 HAT 储存液（（10 mmol/L 次黄嘌呤，40 μmol/L 氨基蝶呤，1.6 mmol/L胸苷）：取 1.36 g 次黄嘌呤、729 μl 氨基蝶呤（取自25 mg/ml 储存液）、0.387g 胸背以及 0.022 g 甘氨酸，溶于4 ml 的 5 mol/L NaOH +26 ml 超纯水中。用超纯水补至1 L，过滤除菌）混合（稀释到终末1:100 )），至少 30 s，轻摇振荡 90 s。
8. 最后，加入 8 ml HAT 培养基，至少 30 s，轻摇振荡 90 s。
9. 将上述 16 ml 混合液移入一个无菌的 Nalgene 瓶中，瓶中预盛 HAT 培养基 ( 如果以最大量融合细胞，则需预盛 125 ml HAT 培养液，换言之如果该 16 ml 细胞悬液中含有上述第 1 步中提到的最大融合细胞密度的话（即 1. 5X108 个），需要补加 125 ml HAT 培养基，则瓶中总体积为 141 ml，加上第 10 步离心洗涤所需培养基，终体积为 150 ml，细胞浓度为 1X106/ml)。
10. 将 50 ml 离心管用 9 ml HAT 淋洗后，移到瓶中。
11. 将瓶内各成分混匀，将细胞悬液移至消毒的多道盛液池。
12. 使用 12 道加样器，按 200 μl/孔的量将细胞接种到 96 孔培养皿上，每孔的细胞总数为 2X105/ml。
杂交瘤的筛选
1. 融合 5 天后换液，将原培养基尽量吸去，重新加入新鲜 HAT 培养基（150~200 μl/孔）以维持细胞生长。
2. 每周换液两次。
3. 融合后两周，通过 ELISA 法筛査阳性杂交克隆。
4. 再经 48 h ，重新进行 ELISA 检测，以确定该阳性克隆。
5. 在 96 孔板上划出两个孔，将抗体分泌最高的（阳性）杂交瘤细胞克隆移入这两个孔内，加含 10% FBS 及 HT 的培养基培养。
6. 重新检测细胞。在一个 24 孔板上扩增培养阳性杂交瘤细胞，在撤去 HT 培养基（用基础培养基将 100X HT 储存液（取 0.408 g 次黄嘌呤、0.1161 g 胸苷和 0.0067g 甘氨酸，溶于2 ml 5 mol/L NaOH + 8 ml 超纯水中，用超纯水补液至 300 ml。过滤除菌）稀释（同上述H A T 培养基））时，取 2 ml 培养上清进行筛査。此步骤中，应取足量的上清，进行多次重复测定，以确定该抗体是所免疫抗原的特异产物。
7. 于 24 孔培养板分出 4 孔，进行杂交瘤细胞的扩增，并冷冻保存细胞（见方案 20.1)。
8. 于一个 75 cm2 培养瓶中再次扩大培养杂交瘤细胞，之后再次冷冻保存。
来源：丁香实验
