有限稀释克隆法

 

附 加 材 料（其他材料见基本方案 2)

候 选 杂 交 瘤 系（见辅助方案 2)

克隆和扩增用培养基（见辅助方案 4)

微 孔 板 观 察 镜（由 Flow 实验室或 Dynatech 公司提供），可选的

1.重悬候选杂交瘤所在孔中的细胞（见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 4)，用血细胞计数器和台盼蓝 拒 染 试 验（附 录 3C) 对 一 部 分（50|ul) 细胞进行计数和细胞活力测试。

2.以每毫升 5 0 个活细胞和每毫升 5 个活细胞的量分别准备 IOml 含有克隆和扩增用养 基 的 细 胞 悬 液（根据需要多次稀释）。将 细 胞 悬 液 移 种 至 9 6 孔 板 ，每 个 孔 200ul(最终每孔分别为 1 0 个细胞和 1 个细胞）。 CO2 培养箱中培养 7〜10d。

3.观察出现杂交瘤生长的孔数，以确定哪一种稀释度对于单克隆的生长是最佳的。把孔板举高肉眼观察或使用微孔板观察镜对杂交瘤进行观察。

4.在继续细胞培养之前，用倒置显微镜观察单克隆细胞。单一的致密细胞集落是单克隆细胞增殖的典型特征，而多克隆细胞增殖往往出现多个细胞集落，尽可能不要使用多克隆细胞生长的孔。

5.应用与筛选主要孔细胞（见辅助方案1 ) 相同的方法检测培养 7〜14d 的单克隆细胞分泌目标抗体的活性（对于小鼠-小鼠杂交瘤应于第 7 天 ；所有的孔都应该在其颜色变黄时进行检测）。使用部分原杂交瘤的培养上清（见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 6 ) 作为阳性对照。

6.如果已经确定得到了所需的细胞克隆，按与原杂交瘤相同的方法（见辅助方案2 ) 扩增并冻存这个细胞克隆。

7.按 步 骤 1 和 2 再次克隆阳性杂交瘤克隆，配 制 含 有 6 0 个 活 细 胞 的 40m l 克隆用培养基（最 终 为 0.3 个细胞/孔），重复步骤 4〜6。

8.连 续 3 天 ，每天以 1 : 2 的比例将再次克隆的细胞转入 DMEM-10完全/HEPES/丙酮酸钠培养液，以使所需的杂交瘤成为稳定的细胞系。一株偶然克隆的杂交瘤会无法适应 DMEM-10完全/ HEPES / 丙酮酸钠培养液的环境，并要求较高浓度的 FCS。 因此，在 转 入 DMEM-10培养基之前先将细胞转入 DMEM-1 5 培养基。在此过程中应谨防支原体污染（附 录 3F)。

9.在不同天数冻存多个装有细胞的小瓶（含各不相同量的冻存用培养基，见 附 录 3B)。复苏样品瓶，以适当方法检测细胞生长活性和培养上清中单克隆抗体（MAb) 的活性 。应用杂交瘤大规模制备腹水和培养上清（单 元 1.4)。检 测 M A b 的 同 种 型（单元 1. 1)

即使是再次克隆的杂交瘤也会具有不稳定性，尤其是某些仓鼠-小鼠杂交瘤。这样的杂交瘤需要继续进行克隆。长时间的体外培养可能导致 M Ab 的不分泌。为了减少这一问题带来的影响，将部分已知可以生产 M Ab 的细胞冻存起来是必要的，同时这些细胞将来也可以作为活性细胞的来源。