杂交瘤的克隆化:有限稀释法
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杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多,最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
有限稀释法克隆步骤为:
(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。
(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干,计数。
(3)调整细胞为3~10个细胞/ml。
(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板,每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。
(5)在第7天换液,以后每2~3天换液1次。
(6)8~9天可见 细胞克隆形成,及时检测抗体活性。
(7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
(8)每个克隆应尽快冻存。