ELISPOT与ELISA、有限稀释法等5种检测方法的区别

ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ，HPF)，这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。

后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IL-10 ， TNFα和IL-6) 数量的手段也被建立起来。

Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis ，CVIA) 自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量。

计算与负载抗原 肽的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC) 中抗原特异性CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。

ELISA 通过显色反应，在酶标仪 上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

(某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率) 由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

LDA能够对特异性CTL细胞进行定量，曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞(memorial CTL， mCTL) 亚群的细胞周期。

但该方法需要高强度抗原刺激， 这会加快效应CTL(eCTL)凋亡，且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次，该方法较繁琐，培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。

最近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强，即使当体内mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外，最主要缺点是表位的选择。

由于每次反应只能分析单一的抗原表位，而MHCⅠ类分子结合的各种表位，能否形成CTL反应，却随着基因背景及时间的变化而变化，因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行，但对整个肽库进行扫描，并不是一件很容易的事。

当然，生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时，有研究结果表明，并非所有经过Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能， Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍，其中很多是不表现功能的惰性细胞，可能代表了记忆型CTL前体细胞。

Tetramer分析只增加了分析的灵敏度，同时测定其功能很重要。