Elisa结果不是特别好，老板让做elispot.有详细的步骤么有大佬做过么，要注意什么

直接间接法

刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。

在培养液中稀释PBMC，其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加5X104至3x105个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作最佳选择。

操作过程

1. 用50ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育1分钟。

2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。

3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 盖上板盖，4℃过夜。

4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。

5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。

6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

7.用100ul PBS洗涤一次。

8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。

9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。

11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。

12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，室温下孵育2小时 。

13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，室温下孵育1小时。

15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。

18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。此板在室温下避光保存。

ELISpot实验步骤与原理示意

大致原理上分为如下7个步骤

Step.1 包被：将单克隆捕获抗体添加到乙醇处理的PVDF膜板上

Step.2 细胞孵育：在有刺激的情况下加入细胞，孵育，细胞分泌细胞因子

Step.3 捕获分泌物：激活后的细胞，分泌的细胞因子被周围的抗体结合捕获

Step.4 检测抗体：去除细胞，清洗平板，加入生物素化的检测抗体

Step.5 链霉亲和素-酶偶联物：加入链霉亲和素偶联物，保证后续在膜上形成斑点

Step.6 加反应底物：当酶催化时，显色底物形成不溶性沉淀

Step.7 结果分析：在自动点阅读器中对结果进行分析。每个斑点对应一个分析物分泌细胞

以下是一般的Elispot实验步骤：

准备试剂和细胞：根据实验需要准备所需的细胞、培养基、ELISPOT板、抗体、荧光素底物等试剂。

处理细胞：将需要检测的细胞进行处理，如给予刺激、培养等，以促进细胞对特定蛋白质的产生。

将处理后的细胞均匀地分布于ELISPOT板上。

加入特定蛋白质的抗体并孵育，使其与产生的蛋白质结合。

洗涤ELISPOT板以去除未结合的抗体和细胞。

加入二级抗体，与细胞分泌的蛋白质结合。

加入荧光素底物，使产生的信号可视化。

使用显微镜或Elispot分析软件对板上的斑点进行计数和分析。

在进行Elispot实验时，需要注意以下事项：

选择合适的实验条件：包括刺激物、细胞浓度、孵育时间等因素。

保证实验板的清洁：在实验前、实验中和实验后都需要对板进行清洁，避免干扰实验结果。

控制实验的质量：实验需要进行严格的质量控制，包括阳性和阴性对照，以保证实验结果的准确性。

数据分析：需要使用合适的数据分析方法对实验结果进行统计分析和解释。