克隆和扩增用培养基的制备

附 加 材 料（其他材料见基本方案 2)

小鼠（以 BALB/c 小鼠为例）， 5 或 6 只 ， 4〜6 周龄，无 病 原 体（有可靠来源，避免支原体感染）

75 cm2 组织培养用细颈瓶

0.45 过滤装置

1.用颈椎脱臼法或二氧化碳窒息法处死 5 或 6 只 小 鼠（附 录 2 G; 避免使用麻醉剂）。无菌操作取出胸腺（附 录 2 H) 并 制 成 单 细 胞 悬 液 （见基本方案2 , 步 骤 7〜9)。在20m l 添 加 lOmmol/L HEPES和 lmmol/L 丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液中重悬细胞。

2.加IOml 胸 腺 细 胞 至 75 cm2 组 织 培 养 瓶 中 。以 每 个 胸 腺 20m l 培养基的总量加入DMEM-20完全/HEPES/丙 酮 酸 钠 培 养 液 （最多每个培养瓶 60 ml细胞悬液）。垂直放置 ，培 养 4〜5d

3.将 细 胞 悬 液 移 至 无 菌 50m l 锥 底 离 心 管 中 。室 温 下 ， IOOOg 离 心 5 min，取 上 清 。0 .45 Mm 过滤上清液。以 IOml 为一个单位，一 20°C 冻存。解冻后，以 1 0 % 〜2 0 % 的浓度使用。