提问
提问
我要登录
|免费注册
收藏
wx-share
分享

激酶信号级联放大的流式细胞分析实验

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

流式细胞仪通常利用表型分析对细胞群进行分析与鉴定,或对细胞分析相关的项目进行检测,如细胞毒活性、细胞活力及凋亡等。对于利用流式细胞仪来评价或分析复杂细胞群体,如外周血中的细胞亚群是很方便的。在当前蛋白组学分析中, 二维的 SDS-PAGE 凝胶电泳和蛋白翻译后修饰的质谱分析主要是对胞内活化过程进行分析。但是,这些实验的示值读数显示的是细胞被溶解后所有细胞蛋白活化的均值,并不能对细胞群体中单细胞蛋白活化的信息分布进行分析,也不能对活 化蛋白水平进行相应细胞类型的回溯性分析,因而该类方法可能会掩蔽一些生物学信息。如用此 类需要溶解细胞来进行蛋白分析的方法,对人或鼠免疫细胞这类高变异细胞群进行分析时, 免疫细 胞中特定细胞群或在不同细胞亚群间的有意义信息就会被丢失。最后,蛋白活化信号的级联活化 尽量要在其相应的生理状态中进行检测,以避免人为因素的干扰。因此,只有发展对包括单细胞内激酶活性检测在内的胞内生化多参数检测方法,才能对复 杂的异质性群体中特定淋巴细胞亚群的个别生化活动进行分析。多参数流式细胞仪分析可根 据其细胞表型的差异,对不同的细胞亚群、不同细胞分化及活化状态的小细胞群进行分析。目前,用于激酶信号级联放大的流式细胞分析实验的方法主要有 4 种:磷酸单标记、表面分子+胞内分子标记(甲醇再水化法)、表面分子+胞内标记(皂素法)和胞内磷酸化蛋白、胞内因子及表面分子联合标记。

原理

激酶信号级联放大的流式细胞分析实验的基本原理是通过应用特定蛋白磷酸化和非磷酸化的不同磷酸特异性抗体来进行检测。这些高特异性抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)需要通过检测才能应用,以确保其不仅识别磷酸特异性, 还要识别相近关联蛋白类似磷酸残基的特异性。磷酸特异性抗体直接联结到荧光素后,需要确定其合适的荧光/蛋白比率(FTP)、滴度,并在预先定义的刺激条件下进行检测鉴定。有些商业化的药物抑制剂可特异性阻断某些信号的级联活化,可 用来确定该信号途径是否发生磷酸化。然而, 对于大部分磷酸化蛋白而言,对应的此类抑制剂 并不易找到。样本是否进行了诱导、是否进行处理等条件对胞内磷酸化蛋白检测方法的影响较大。因而,对胞内磷酸化蛋白的检测需要考虑多种因素,如培养条件、细胞操作、磷酸检测试剂的特异 性(抗体克隆、荧光比率)、细胞固定与通透等。

来源:丁香实验团队

操作方法

单磷酸标记

单磷酸标记可以同时对多个激酶标记,也能在复杂的细胞群体中,标记完成利用细胞表面分子区分不同细胞亚群,同时也检测其胞内磷酸化蛋白。

甲醇再水化法标记表面分子+胞内分子

甲醇再水化法标记表面分子+胞内分子的相关案例显示在图 4.5B 中,图中人外周血单个核细胞(PBMCs)用不同细胞因子 处理后,同时进行表面分子(CD56 和 CDllb 抗体, 分别是 NK 细胞的标记和 MAC-1 的表达)和 胞内分子(phospho.STAT6)双标记; 然后,根据淋巴细胞亚群信号分子的差异进行设门。

皂素方法标记表面分子+胞内分子

皂素方法标记表面分子+胞内分子案例见图 4-5A, 人外周血单个核细胞用不同细胞因子处理后,对细胞表面分子(CD16 和 CD19)和胞内分子(phospho-STAT6)同时进行标记,以显示淋巴细胞亚群信号的差 异。结果显示 IL4 和 IL-12 刺激后,CD19 阳性细胞 STAT-6 发生磷酸化。用 TNF-a 刺激则可 诱导部分 CD19 阳性细胞 STAT-6 轻度磷酸化,但用干扰素和

胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析

胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析最适于新鲜分离 PBMCs 的分析。用 Ficoll-Paque 密度离心分离 PBMCs,PBMCs 直接应经于分析或经细胞分选(磁分选或 FACS 分选)富集其中的某一特定群体后,将细胞进 行刺激, 并进行标记。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序