胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析

胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析最适于新鲜分离 PBMCs 的分析。用 Ficoll-Paque 密度离心分离 PBMCs,PBMCs 直接应经于分析或经细胞分选（磁分选或 FACS 分选）富集其中的某一特定群体后，将细胞进 行刺激, 并进行标记。

胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析的基本过程可分为如下几步：

（一）细胞准备

A 按（0.5〜1）×106/100μL 培养基/每孔, 将 PBMCs（或纯化细胞）铺至 96 孔 U 底培养板中。

B 用设定的刺激剂在 37℃ 条件下刺激所需要的时间。

C 设相应对照:①对所有颜色设单色对照（阳性和阴性）；②磷酸化蛋白对照（如刺激 与不刺激组）；③对自发荧光所设的不标记对照，和④针对背景染色的胞内同型对照。

D 加入 100μL 磷酸缓冲液收获细胞，离心（500 g,4℃,5 min）, 轻轻拍打培养板, 立即用 冰冷的胞外标记缓冲液 ［（1〜2）×106。细胞用 50μL］ 重悬细胞, 并置于 4℃。

（二）细胞表面分子标记

A 将样本与细胞表面标记混合液（50μL 胞外标记缓冲液）避光冰上孵育 15 min。

B 加入 150μL 磷酸洗涤缓冲液并离心（500 g, 4℃）。用 200μL 磷酸洗涤缓冲液洗 1 次， 压紧细胞。

（三）固定与通透

A 避光, 冰浴条件下用 100μL 固定缓冲液固定细胞 30 min。如用储存液，最终浓度应 在 1%〜2%。

B 加入 100μL 磷酸洗涤缓冲液, 并压紧细胞。用 200μL 磷酸洗涤缓冲液洗 1 次，压紧 细胞。

C 用 200μL 通透缓冲液通透，上下吹打 4〜5 次。避光,4℃ 条件下孵育 15 min。

D 加入 100μL 磷酸洗涤缓冲液，离心细胞, 并轻轻拍打培养板。

（四）胞内染色

A 在避光、冰浴条件下，用 50μL 胞内标记混合液（用通透缓冲液制备）重悬细胞至少 30 min（通常足够）。在室温条件下孵育更长时间（lh）能增加某些标记抗体的标记效果。加入 150μL 通透缓冲液并离心。

B 用 200 心通透缓冲液洗 1 或 2 次（2 次洗涤通常足够，但更多次洗涤可降低背景）。

C 用 PBS-EDTA（100 〜200μL）重悬，并转移至 FACS 管。

D 流式细胞仪分析。