简介
胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析最适于新鲜分离 PBMCs 的分析。用 Ficoll-Paque 密度离心分离 PBMCs,PBMCs 直接应经于分析或经细胞分选（磁分选或 FACS 分选）富集其中的某一特定群体后，将细胞进 行刺激, 并进行标记。
材料与仪器
器材： 96 孔 U 底培养板、离心机等。
试剂：
①1 x PBS（磷酸缓冲液）：称取 1.44 g Na2 HPO4,0. 24 g KH2PO4,8 g NaCl 和 0. 2 g KC1 溶 于 850 ml 双蒸水。用 HC1 校其 pH 至 7.4, 并补足其体积至 1 L, 常温保存。
②胎牛血清（标准细胞培养用血清），4℃ 保存。
③甲醛：4%〜36% 多聚甲醛自制或购买（我们用 16% 多聚甲醛,Electron Microscopy Sciences 公司产品,cat. no. 15710, Washington,PA）。常温保存。
④染色液：1 xPBS,4% FCS, 和 ImM 叠氮纳。4℃ 保存。
⑤EDTA：制备 5M 储存液，制备 PBS-EDTA 缓冲液应用。EDTA 被用来避免在流式细胞 仪获样过程中形成细胞团。常温保存。
⑥PBS-EDTA：PBS 和 1 mM EDTA。 常温保存。
⑦皂素：称取 10 g 皂素（皂素含量≥25%, Sigma, St. Louis, M0）溶于 100 ml PBS, 制备 10% 皂素储存液。37℃ 轻轻搅拌, 直至皂素全部溶解。无菌滤膜过滤（0.22μm）,4℃ 保存。
⑧磷酸洗涤缓冲液:PBS,lmM 磷酸甘油酯,1 mM 原飢酸钠,1 μg/mL 微囊藻素（500 μg 小玻璃瓶可从 Calbiochem 购买，现在的 EMD Biosciences, Inc. ,San Diego, C A）,1 mM 叠氮化物。 这是所有后面用到的缓冲液的基础缓冲液。4℃ 保存。
⑨皂素通透缓冲液: 磷酸洗涤缓冲液,0.2% 皂素,4% FCS,lmM 叠氮化物。4℃ 保存。 最后通透时皂素的终浓度每样本不能高于 0.1%。用 0.2% 的浓度来补偿洗涤后孔中残留的液体。4℃ 保存。
⑩皂素染色缓冲液：同皂素通透缓冲液
⑪胞外染色缓冲液：磷酸洗涤缓冲液,4% FCS, 和蛋白酶抑制剂混合片剂 (Boehringer Mannheim, 现在的 Roche Applied Science, Indianapolis, IN)。4℃ 保存。
⑫固定缓冲液: 用磷酸洗涤缓冲液制备 1% 多聚甲醛。4℃ 保存。
⑬通透缓冲液: 磷酸洗涤缓冲液,0.2% 皂素和 4% FCS。这也用于制备胞内染色混合液。4℃ 保存。
步骤
胞内磷酸化蛋白、细胞因子标记和表面标志的结合分析的基本过程可分为如下几步：
（一）细胞准备
A 按（0.5〜1）×106/100μL 培养基/每孔, 将 PBMCs（或纯化细胞）铺至 96 孔 U 底培养板中。
B 用设定的刺激剂在 37℃ 条件下刺激所需要的时间。
C 设相应对照:①对所有颜色设单色对照（阳性和阴性）；②磷酸化蛋白对照（如刺激 与不刺激组）；③对自发荧光所设的不标记对照，和④针对背景染色的胞内同型对照。
D 加入 100μL 磷酸缓冲液收获细胞，离心（500 g,4℃,5 min）, 轻轻拍打培养板, 立即用 冰冷的胞外标记缓冲液 ［（1〜2）×106。细胞用 50μL］ 重悬细胞, 并置于 4℃。
（二）细胞表面分子标记
A 将样本与细胞表面标记混合液（50μL 胞外标记缓冲液）避光冰上孵育 15 min。
B 加入 150μL 磷酸洗涤缓冲液并离心（500 g, 4℃）。用 200μL 磷酸洗涤缓冲液洗 1 次， 压紧细胞。
（三）固定与通透
A 避光, 冰浴条件下用 100μL 固定缓冲液固定细胞 30 min。如用储存液，最终浓度应 在 1%〜2%。
B 加入 100μL 磷酸洗涤缓冲液, 并压紧细胞。用 200μL 磷酸洗涤缓冲液洗 1 次，压紧 细胞。
C 用 200μL 通透缓冲液通透，上下吹打 4〜5 次。避光,4℃ 条件下孵育 15 min。
D 加入 100μL 磷酸洗涤缓冲液，离心细胞, 并轻轻拍打培养板。
（四）胞内染色
A 在避光、冰浴条件下，用 50μL 胞内标记混合液（用通透缓冲液制备）重悬细胞至少 30 min（通常足够）。在室温条件下孵育更长时间（lh）能增加某些标记抗体的标记效果。加入 150μL 通透缓冲液并离心。
B 用 200 心通透缓冲液洗 1 或 2 次（2 次洗涤通常足够，但更多次洗涤可降低背景）。
C 用 PBS-EDTA（100 〜200μL）重悬，并转移至 FACS 管。
D 流式细胞仪分析。
来源：丁香实验
