细胞内细胞因子染色步骤

一、样本准备

1. 收集细胞，200 目筛网过滤，收集滤液，300g 离心 5 min，弃上清。
2. 向细胞中加入适量细胞染色 buffer(或含1%BSA的PBS)，用移液枪轻轻吹打细胞重悬。

二、细胞计数

用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为 1 × 10⁷/mL。

三、设置实验分组

根据实验设计，设置实验分组，每管加入 100μL 细胞悬液。

四、封闭 Fc 受体

封闭 Fc 受体能减少染色过程中的非特异性染色。

小鼠中，纯化的 CD16/CD32 单抗能和 FcγR Ⅲ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入 0.5-1μg 纯的抗小鼠 CD16/32 单克隆抗体，室温孵育 10min。

对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化 Ig 或者与目标种属相同来源血清进行阻断，或者用商业化的 Fc 受体阻断剂。

五、细胞表面抗体孵育

根据实验设计，除空白对照外，对应的单染管、全染管加入相应的抗体 5μL，混匀，4℃ 避光孵育 30min。

六、固定破膜

1. 按照说明书稀释固定破膜液。
2. 每管加入1mL 细胞染色 buffer，300g 离心 5min，弃上清。
3. 加入100μL 细胞染色 buffer，重悬细胞。
4. 每管加入1mL 的 1× Fixation Working Solution，轻柔混匀，4℃ 避光孵育 30min。
5. 600g 离心 5min，弃上清。
6. 每管加入2mL 的 1×Permeabilization Working Solution，轻柔混匀。
7. 600g 离心 5min，弃上清。
8. 重复（6）、（7）步一次。

七、胞内抗体孵育

1. 加入100μl 的1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。
2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体 5μL，混匀。
3. 室温避光孵育 30 分钟。
4. 加入1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。
5. 600g 离心 5 分钟，弃上清。

八、上机检测

1. 加入 200μL 细胞染色 buffer，重悬细胞。
2. 调整仪器参数，上机检测。