流式细胞表面染色步骤

一、样本准备

详见流式细胞术样本制备技术、流式实验样本制备方法及注意事项

1. 收集细胞，200 目筛网过滤，收集滤液，300 g 离心 5 min，弃上清
2. 向细胞中加入适量细胞染色 buffer（或含 1%BSA 的 PBS），用移液枪轻轻吹打细胞重悬

二、细胞计数

用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为 1 × 10⁷/mL

三、设置实验分组

四、封闭 Fc 受体

封闭 Fc 受体能减少染色过程中的非特异性染色。

小鼠中，纯化的 CD16/CD32 单抗能和 FcγRⅢ/Ⅱ 结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入 0.5-1 μg 纯的抗小鼠 CD16/32 单克隆抗体，室温孵育 10 分钟。

对于人和大鼠，可直接使用过量的，与荧光抗体相同来源和亚型的纯化 Ig 或者与目标种属相同来源的血清进行阻断，或者用商业化的 Fc 受体阻断剂。

五、细胞染色

1. 按照说明书的推荐用量加入荧光标记抗体，混匀后置于 4℃，避光孵育 30 分钟。
2. 加入细胞染色 buffer (或含 1%BSA 的 PBS)重悬细胞，300g 离心细胞悬液 5 分钟，弃掉上清。
3. 加入 200μL 细胞染色buffer（或含 1%BSA 的 PBS）重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。