浅谈流式核内蛋白染色步骤

互联网2021-11-24

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浅谈流式核内蛋白染色步骤：

1、染表面抗体按说明书条件孵育全血样品孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素（按厂家说明操作）溶血完毕。

2、用2ml预冷流式染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer）洗涤细胞300-400g离心5分钟，去上清。

3、用3倍体积的固定/破膜稀释液（#00-5223）稀释固定/破膜浓缩液（#00-5123）制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为1ml 。

4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（1:3稀释好）再次旋涡混匀，

避光4℃孵育30分钟到60分钟。

5、将破膜缓冲液（#00-8333）用去离子水1:9稀释，制成工作液（每个样本的用量为4~5ml）。

6、无需洗涤，直接加入2ml破膜缓冲液工作液（1：9稀释好）300-400g离心洗涤细胞并弃去上清液（可选）重复洗涤一次。

7、加入100 ul流式染色缓冲液重悬细胞体系中加入2 ul 胞内抗体来源的血清，室温避光孵育30分钟。

8、体系加入适量的核内（及胞浆）抗原抗体，对照管加入等量的同型对照，按说明书条件孵育。

9、加入2ml破膜缓冲液工作液离心洗涤细胞并弃去上清液（可选）重复洗涤一次。

10、用500ul 流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析,如不能立即检测，用0.5ml 0.1~4%多聚甲醛重悬，避光4℃保存24小时内上机分析。
相关产品信息：

品牌	目录号	产品名称	规格
ebioscience	00-5523-00	Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set Kit	Kit
ebioscience	00-4222-26	Flow Cytometry Staining Buffer	600 mL
Jiamay	4222-261	Flow cytometry Staining buffer	125ml
Jiamay	4222-262	多聚甲醛溶液，4%	100mL
Jiamay	4222-263	FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X	100T
Jiamay	4222-264	FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X	250T
Jiamay	4222-265	FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X	500T

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流式CBA多因子检测外包实验介绍

虽然液相蛋白定量检测的技术很多，但是大多数的技术仅能对样本进行单一指标的检测，同时检测多个指标时则需要提供大量的样本分批检测，操作繁琐，且各指标间差异性较大。对于样本量较少或需要对比各指标的用户，传统的技术无法满足需要。

日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析，由于这些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用常规的蛋白检测方法Western Blot等很难检测。为此，著名的流式抗体公司BD-Pharmingen开发了基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术——CBA。

CBA工作原理：Cytometric Bead Array（CBA），即细胞因子微球检测技术。是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。

CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。

流式CBA多因子检测外包实验

详细原理介绍：每个CBA微球大小一致，具有特定的荧光强度，包被有适用于特定分析（如其它抗体或者可溶性蛋白）的特异性捕获抗体（Capture Antibody），提供了类似ELISA孔板的捕获表面。当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或者细胞培养液）中相应的抗原或蛋白结合，然后加入荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹心复合物。最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。

CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光，在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性；检测抗体带有PE荧光素标记，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。

流式CBA多因子检测外包实验

CBA技术特点：CBA是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面，捕获微球与待测样品后，呈悬浮态，与ELISA相比，能更有效地捕获被分析物；CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。

下面我们介绍一下CBA主要的技术特点:
1、轻松实现多重检测。最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。

2、样本需要量小。仅需要50μL溶液就可进行一次检测。

3、更高的灵敏度。分析灵敏度高达2.8pg/mL。

4、更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml，所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量，排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。

5、检测对象的灵活组合—BD CBA Flex Set。CBA kit是同时检测试剂盒配好的6个指标，形式比较固定。为满足不同客户的实际需要和研究兴趣，BD于2005年初推出了CBA Flexset。它改变了CBAkit的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的“自助餐”。您可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标，最多能同时检测75个指标。除了拥有CBAkit的优势外，Flex Set还配有独立的软件分析系统（CBA Flex Set Analysis Software），并且可以在BDFACSArray Bioanalyzer上，直接用96孔和384孔板进行操作。CBA Flex set赋予研究者更灵活、更自由，更大的选择空间，而且进一步丰富了CBA产品线。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析。

6、操作简单，省时省力。CBA技术采用芯片式集成测定，所有检测只需一组标准曲线，就可计算出每种待测蛋白浓度；操作简单，整个流程只需要3.5小时，对待测样本可做实时分析，缩短检测了时间，提高了检测效率。

7、强大的软件分析系统。BD CBA软件具有强大的数据处理能力，直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度；除了为用户提供待测物的计数结果外，还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于Macintosh和Microsoft系统两种版本供您选择。和传统的液相蛋白定量技术相比，CBA技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点：

传统ELISA	流式CBA检测技术
单项检测	多参数检测
每项实验样本用量50-200ul	样本用量少于50ul
需要抗原包被	操作方便，节省时间
实验时间大于24h	流式细胞仪自动检测，标准曲线自动测定，专用软件自动计算
酶-底物背景干扰	无酶-底物背景干扰

CBA应用：自CBA上市以来，越来越多的科研和临床研究人员将CBA应用于他们的领域。CBA应用领域涉及眼泪、血清、唾液、细胞培养上清等样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析。CBA还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析，系统性红斑狼疮（SLE）和新生儿脓血症等免疫疾病的监控，肿瘤研究，药物对病人的治疗效果评估，药物研发，疫苗研究，总体免疫功能分析等多领域。

CBA指标检测明细:
1、CBA指标

目录号	产品说明	检测指标
557800	Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-γ
560485	Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10
551287	Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ,TNF
552364	Mouse Inflammation Kit	IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70
550026	Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit	Heavy and light chain isotypes of mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, and IgE
560484	Human Th1/Th2/Th17 Kit	IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A
550749	Human Th1/Th2 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g
551809	Human Th1/Th2 Cytokine Kit II	IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g
551811	Human Inflammatory Cytokine Kit	IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70
552990	Human Chemokine Kit	IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10
561418	Human Anaphylatoxin Kit	C3A,C4A,C5A

2、CBA Flex Set 细胞因子检测指标

Human	Mouse	Rat
IFN-γ,INF-α IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11,IL-12, IL-12p70, IL-13,IL-17A, IL-21, IL-23p40 TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ IP-10 I-TAC MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β Eotaxin RANTES CD54(ICAM-1) CD62E,CD62P,CD62L CD106(VCAM-1) sCD40 sCD154	sCD121a,sCD121b Soluble CD14 Basic FGF VEGF Angiogenin G-CSF,GM-CSF LIF LT-α OSM Granzyme A, Granzyme B Fas Ligand(FasL) Fractalkine IgA, IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgM, Total IgG,	IFN- γ IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40, TNF MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β RANTES KC CD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin) G-CSF,GM-CSF	IFN- γ IL-1 α, IL-4 , IL-6, IL-10 TNF

3、CBA Flex Set 信号转导指标

Phospho Akt1(S473)	Phospho Akt2(S474)
Phospho BLNK (Y84)	Phospho p120 Catenin(Y228)
Phospho Btk (Y551)	Phospho MEK1/2(S222)
Phospho eNOS (S1177)	Phospho Paxillin(Y118)
Phospho ERK1/2 (T202/Y204)	Phospho Pyk2(Y402)
Phospho Itk (Y511)	Phospho SLP-76(Y145)
Phospho JNK1/2 (T183/Y185)	Phospho c-jun(S63)
Phospho p38 (T180/Y182)	Phospho stat3
Phospho PLCg (Y783)	Total Stat1
Phospho Rsk (T573)	Total Syk
Phospho Stat1 (Y701)	Total ZAP70
Phospho Syk (Y352)	Phospho ZAP70 (Y319)

4、CBA Flex Set 干细胞指标

Human Rex-1 Flex Set	Human Nanog Flex Set
Human Oct-4 Flex Set