浅谈流式核内蛋白染色步骤
嘉美纽诺
浅谈流式核内蛋白染色步骤：
1、染表面抗体 按说明书条件孵育全血样品孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素（按厂家说明操作）溶血完毕。
2、用2ml预冷流式染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer）洗涤细胞300-400g离心5分钟，去上清。
3、用3倍体积的固定/破膜稀释液（#00-5223）稀释固定/破膜浓缩液（#00-5123）制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为1ml 。
4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（1:3稀释好）再次旋涡混匀，
避光4℃孵育30分钟到60分钟。
5、将破膜缓冲液（#00-8333）用去离子水1:9稀释，制成工作液（每个样本的用量为4~5ml）。
6、无需洗涤，直接加入2ml破膜缓冲液工作液（1：9稀释好）300-400g离心洗涤细胞并弃去上清液（可选）重复洗涤一次。
7、加入100 ul流式染色缓冲液重悬细胞体系中加入2 ul 胞内抗体来源的血清，室温避光孵育30分钟。
8、体系加入适量的核内（及胞浆）抗原抗体，对照管加入等量的同型对照，按说明书条件孵育。
9、加入2ml破膜缓冲液工作液离心洗涤细胞并弃去上清液（可选）重复洗涤一次。
10、用500ul 流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析,如不能立即检测，用0.5ml 0.1~4%多聚甲醛重悬，避光4℃保存24小时内上机分析。
相关产品信息：
| 品牌 | 目录号 | 产品名称 | 规格 |
| ebioscience | 00-5523-00 | Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set Kit | Kit |
| ebioscience | 00-4222-26 | Flow Cytometry Staining Buffer | 600 mL |
| Jiamay | 4222-261 | Flow cytometry Staining buffer | 125ml |
| Jiamay | 4222-262 | 多聚甲醛溶液，4% | 100mL |
| Jiamay | 4222-263 | FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X | 100T |
| Jiamay | 4222-264 | FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X | 250T |
| Jiamay | 4222-265 | FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X | 500T |
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流式CBA多因子检测外包实验介绍
虽然液相蛋白定量检测的技术很多，但是大多数的技术仅能对样本进行单一指标的检测，同时检测多个指标时则需要提供大量的样本分批检测，操作繁琐，且各指标间差异性较大。对于样本量较少或需要对比各指标的用户，传统的技术无法满足需要。
日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析，由于这些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用常规的蛋白检测方法Western Blot等很难检测。为此，著名的流式抗体公司BD-Pharmingen开发了基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术——CBA。
CBA工作原理：Cytometric Bead Array（CBA），即细胞因子微球检测技术。是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。
CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。
详细原理介绍：每个CBA微球大小一致，具有特定的荧光强度，包被有适用于特定分析（如其它抗体或者可溶性蛋白）的特异性捕获抗体（Capture Antibody），提供了类似ELISA孔板的捕获表面。当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或者细胞培养液）中相应的抗原或蛋白结合，然后加入荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹心复合物。最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。
CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光，在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性；检测抗体带有PE荧光素标记，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。
CBA技术特点：CBA是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面，捕获微球与待测样品后，呈悬浮态，与ELISA相比，能更有效地捕获被分析物；CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。
下面我们介绍一下CBA主要的技术特点:
1、轻松实现多重检测。最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。
2、样本需要量小。仅需要50μL溶液就可进行一次检测。
3、更高的灵敏度。分析灵敏度高达2.8pg/mL。
4、更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml，所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量，排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。
5、检测对象的灵活组合—BD CBA Flex Set。CBA kit是同时检测试剂盒配好的6个指标，形式比较固定。为满足不同客户的实际需要和研究兴趣，BD于2005年初推出了CBA Flexset。它改变了CBAkit的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的“自助餐”。您可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标，最多能同时检测75个指标。除了拥有CBAkit的优势外，Flex Set还配有独立的软件分析系统（CBA Flex Set Analysis Software），并且可以在BDFACSArray Bioanalyzer上，直接用96孔和384孔板进行操作。CBA Flex set赋予研究者更灵活、更自由，更大的选择空间，而且进一步丰富了CBA产品线。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析。
6、操作简单，省时省力。CBA技术采用芯片式集成测定，所有检测只需一组标准曲线，就可计算出每种待测蛋白浓度；操作简单，整个流程只需要3.5小时，对待测样本可做实时分析，缩短检测了时间，提高了检测效率。
7、强大的软件分析系统。BD CBA软件具有强大的数据处理能力，直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度；除了为用户提供待测物的计数结果外，还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于Macintosh和Microsoft系统两种版本供您选择。和传统的液相蛋白定量技术相比，CBA技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点：
| 传统ELISA | 流式CBA检测技术 |
| 单项检测 | 多参数检测 |
| 每项实验样本用量50-200ul | 样本用量少于50ul |
| 需要抗原包被 | 操作方便，节省时间 |
| 实验时间大于24h | 流式细胞仪自动检测，标准曲线自动测定，专用软件自动计算 |
| 酶-底物背景干扰 | 无酶-底物背景干扰 |
CBA应用：自CBA上市以来，越来越多的科研和临床研究人员将CBA应用于他们的领域。CBA应用领域涉及眼泪、血清、唾液、细胞培养上清等样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析。CBA还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析，系统性红斑狼疮（SLE）和新生儿脓血症等免疫疾病的监控，肿瘤研究，药物对病人的治疗效果评估，药物研发，疫苗研究，总体免疫功能分析等多领域。
CBA指标检测明细:
1、CBA指标
| 目录号 | 产品说明 | 检测指标 |
| 557800 | Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit | IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-γ |
| 560485 | Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit | IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10 |
| 551287 | Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit | IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ,TNF |
| 552364 | Mouse Inflammation Kit | IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70 |
| 550026 | Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit |
Heavy and light chain isotypes of mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, and IgE |
| 560484 | Human Th1/Th2/Th17 Kit | IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A |
| 550749 | Human Th1/Th2 Cytokine Kit | IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g |
| 551809 | Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g |
| 551811 | Human Inflammatory Cytokine Kit | IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70 |
| 552990 | Human Chemokine Kit | IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10 |
| 561418 | Human Anaphylatoxin Kit | C3A,C4A,C5A |
2、CBA Flex Set 细胞因子检测指标
| Human | Mouse | Rat | |
|
IFN-γ,INF-α IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11,IL-12, IL-12p70, IL-13,IL-17A, IL-21, IL-23p40 TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ IP-10 I-TAC MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β Eotaxin RANTES CD54(ICAM-1) CD62E,CD62P,CD62L CD106(VCAM-1) sCD40 sCD154 |
sCD121a,sCD121b Soluble CD14 Basic FGF VEGF Angiogenin G-CSF,GM-CSF LIF LT-α OSM Granzyme A, Granzyme B Fas Ligand(FasL) Fractalkine IgA, IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgM, Total IgG, |
IFN- γ IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40, TNF MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β RANTES KC CD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin) G-CSF,GM-CSF |
IFN- γ IL-1 α, IL-4 , IL-6, IL-10 TNF |
3、CBA Flex Set 信号转导指标
| Phospho Akt1(S473) | Phospho Akt2(S474) |
| Phospho BLNK (Y84) | Phospho p120 Catenin(Y228) |
| Phospho Btk (Y551) | Phospho MEK1/2(S222) |
| Phospho eNOS (S1177) | Phospho Paxillin(Y118) |
| Phospho ERK1/2 (T202/Y204) | Phospho Pyk2(Y402) |
| Phospho Itk (Y511) | Phospho SLP-76(Y145) |
| Phospho JNK1/2 (T183/Y185) | Phospho c-jun(S63) |
| Phospho p38 (T180/Y182) | Phospho stat3 |
| Phospho PLCg (Y783) | Total Stat1 |
| Phospho Rsk (T573) | Total Syk |
| Phospho Stat1 (Y701) | Total ZAP70 |
| Phospho Syk (Y352) | Phospho ZAP70 (Y319) |
4、CBA Flex Set 干细胞指标
| Human Rex-1 Flex Set | Human Nanog Flex Set |
| Human Oct-4 Flex Set |
嘉美实验期待着在流式CBA的检测中与您合作。更多的实验、技术及产品的咨询，请联系嘉美生物！
