合作专家 | 李煜钰博士
病理学与病理生理 首都医科大学
审核专家 | 张望博士
感染病学 浙江大学
简介
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪检测单个微粒(单细胞悬液、生物颗粒等)的多项特性或对特定群体加以分选的一门技术,具有快速、准确、客观的特点,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。
原理
特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流内的细胞,产生的光信号被多个接收器所接收,一个是在激光束直线方向上接收到的前向角散射光信号(FSC),其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号,包括侧向角散射光信号 (SSC)和荧光信号。
液流中悬浮的直径从 0.2~150 μm的细胞或颗粒能够使激光束发生散射,细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。
散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收,根据接受到的信号的强弱波动从而反映每个细胞的物理学特征。(通俗的讲就是激光束照射由鞘流液包裹的细胞,产生两种光信号,即散射光信号和荧光信号)。
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发波长不同;每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送到不同的光电倍增管。
用途
液流技术、细胞的计数和分选技术等。
材料与仪器
待检测样本、流式直标抗体、PBS
流式 stain buffer、EP 管
固定剂(4% 多聚甲醛)
红细胞裂解液(血液样本选用)
步骤
一、细胞流式
1、倒掉细胞培养液,用适量 PBS 把细胞洗一遍,将细胞用胰酶或枪吹打下来,1000 rpm离心 15 min,用 1 ml 流式 stain buffer 重悬,放入标好标签的 EP 管中
2、300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清,用 100 μL stain buffer 重悬细胞。
3、加入适量体积的细胞表面标记物偶联抗体或同型对照。
4、4 ℃ 避光孵育 30 min 以上(可放置旋转仪上旋转以充分孵育)
5、加入 1 ml stain buffer 清洗细胞,300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清(如不需要破膜直接跳至第 10 步)
6、加入 100 μl 固定剂,室温下避光孵育 15 分钟。
7、用 1 ml stain buffer 洗涤一次
8、300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清,加入 100 μl 破膜剂和适量体积的胞内抗体或相应同型对照,4 度避光孵育 20min~30min(可放置旋转仪上旋转以充分孵育)。
9、加入 1 ml stain buffer 清洗细胞,300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清。
10、用 200 μL stain buffer 重悬细胞,及时上机分析;或用 200 μL 4% 甲醛固定,2~8 °C 避光保存,并在 24 小时内对固定完的细胞进行分析。
二、组织流式
1、取适量新鲜组织于标记好的 EP 管中,加入 1 ml PBS。用剪刀将组织剪成碎块,用匀浆机将组织匀至单细胞悬液(基本看不到大块组织)。
2、过滤器除去组织残渣
3、300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清,用 100 μL stain buffer 重悬细胞。
4、加入适量体积的细胞表面标记物偶联抗体或同型对照。
5、4 ℃ 避光孵育 20min~30min(可放置旋转仪上旋转以充分孵育)
6、加入 1 ml stain buffer 清洗细胞,300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清(如不需要破膜直接跳至第 11 步)。
7、加入 100 μl 固定剂,室温下避光孵育 15 分钟。
8、用 1 ml stain buffer 洗涤一次。
9、300 g,4 ℃,离心 5 min,弃上清,加入 100 μl 破膜剂和适量体积的胞内抗体或相应同型对照,4 ℃ 避光孵育 30 min 以上(可放置旋转仪上旋转以充分孵育)。
10、加入 1 mL stain buffer 清洗细胞,300 g 4 ℃ 离心 5 min,弃上清。
11、用 200 μLstain buffer 重悬细胞,及时上机分析,或用 200 μL 4% 甲醛固定,2~8 °C 避光保存,并在 24 小时内对固定完的细胞进行分析。
三、全血流式
1、取 100 μl 肝素抗凝的人外周血, 加入适量流式抗体,混匀,4 ℃ 避光孵育 20~30 分钟。(如需破膜可参考上述破膜步骤)
2、加入 1.5×红细胞裂解液 2 ml 混匀,室温避光孵育 10~15 分钟,至液体澄清透明(若溶液未澄清透明,请重新振荡混匀,再放置 2 分钟,至液体澄清透明)。
3、1000 rpm 离心 5 分钟,弃上清。
4、加入 1 ml stain buffer 混匀, 300 g 4 ℃ 离心 5 min,弃上清。
5、用 200 μL stain buffer 重悬细胞,及时上机分析,或用 200 μL 4% 甲醛固定,2~8 °C 避光
保存,并在 24 小时内对固定完的细胞进行分析。
血液或骨髓流式细胞术实验步骤及圈门示意图(Circulation. 2020 Mar 31;141(13):1080-1094.)
心脏或脾脏等其他实体组织流式细胞术实验步骤及圈门示意图(Circulation. 2020 Mar 31;141(13):1080-1094.)
注意事项
1. 我们这里所介绍的是细胞表面抗原的检测,细胞内抗体需要进行破膜步骤。不同胞内抗体需搭配使用不同破膜试剂盒,建议使用前咨询购买抗体的公司需使用何种破膜试剂盒。
2. 流式细胞术一般用于活细胞检测,通常需要当天完成上机前的所有实验,如果当天来不及处理,可以用多聚甲醛固定液固定,然后放置 4° 冰箱隔天进行上机检测。
3. 流式上机前一般需要制备单染管,尤其是进行多重标记,可以进行荧光补偿调节。
常见问题
1. 利用流式细胞术进行多抗体标记时,应该如何选择抗体?
首先需要确定所在实验室使用的流式细胞仪支持的荧光通道,这是最先需要明确的,其次可以通过调研已发表文献,参考文献中使用的多色抗体及门控通道。
来源:丁香实验