DNA和RNA的同步流式分析

流式细胞仪同步分析 DNA 和 RNA 分析提供了细胞的 DNA 含量和细胞转录状态的信息。这一分析方法可以通过利用与 DNA 结合的异染荧光物质以及由静电作用与单链 RNA 结合的异染荧光物质来检测 DNA 以及 RNA。分析的首要条件就是细胞的活性，所以应该使用新鲜处理的细胞。利用流式细胞仪同时分析 DNA/RNA 技术原先是被用于包括多发性骨髓瘤在内的血液恶性肿瘤的分类及生物学鉴定。

流式细胞仪同步分析 DNA 和 RNA 分析的基本原理是通过利用与 DNA 结合的异染荧光物质以及由静电作用与单链 RNA 结合的异染荧光物质来检测 DNA 以及 RNA。分析的首要条件就是细胞的活性，所以应该使用新鲜处理的细胞。

利用流式细胞仪同时分析 DNA/RNA 技术常用于包括多发性骨髓瘤在内的血液恶性肿瘤的分类及生物学鉴定。

器材：

①流式细胞仪

②离心机

试剂：

① 1 mg/ml AO：（注意：AO 是诱变剂。其理化以及毒理学特性还未完全清楚。所以，使用时需小心）称取 50 mg AO 粉末（Polysciences，沃灵顿，宾州；见注释 4.1）放入一干净玻璃杯中，加 50 ml 蒸馏水，用锡纸封口，搅拌至溶解（注意避光）。然后用 1 号沃特曼滤纸过滤后，用锡纸包裹 4 ℃ 避光保存，可稳定保存 1 年（见注释 4.2）。

② 0.2M 柠檬酸：加 19.21 g 柠檬酸（Sigma，圣路易斯，密苏里州）至 500 ml 蒸馏水中，搅拌至溶解，4 ℃ 保存，可稳定保存 2 个月。

③ 10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）：加 2.17 g EDTA（GibcoTM Invitrogen 公司，卡尔斯巴德，加州）至 500 ml 蒸馏水中，振荡溶解，4 ℃ 保存，可稳定保存 2 个月。

④ 含有 2 mM MgCl₂ 的 PBS：将 10 × 的无钙盐及镁盐的 PBS（Irvine Scientific，圣安娜，加州）稀释至 1 ×。然后每升加入 0.408 ml 的 4.9M MgCl₂。调整 pH 为 7.2~7.4。10 × 储存液室温下可以储存至 3 个月。1 × 的储存于 4℃。

⑤ 1M 氯化钠（NaCl）：加 29.0 g NaCl（Fisher，休斯敦，休斯顿）至 500 ml 蒸馏水中，振荡溶解，4 ℃ 保存，可稳定保存 3 个月。

⑥ 0.4 M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）：加 28.39 g Na₂HPO₄（Fisher）至 500 ml 蒸馏水中，振荡溶解，室温保存，22 ℃，可稳定保存 2 个月。

⑦ 10X Triton：加 10 ml Triton X-100（CMS，休斯敦，休斯顿）至 90 ml 蒸馏水中，振荡溶解，4 ℃ 保存，可稳定保存 3 个月。

⑧ 溶液 A：加 1 ml Triton X-100，8 mlN HCL，15 ml 1M NaCl 加 76 ml 至蒸馏水中，用 1N HCL 调整 pH 至 1.2。4 ℃ 保存，可稳定保存 2 周。

⑨ 溶液 B：加 50 ml 10 mM 的 EDTA，75 ml 1M NaCl，157.5 ml 0.4M Na₂HPO₄，92.5 ml 的 0.2M 柠檬酸至 120 ml 的蒸馏水中，用 1N HCL 或 1N NaOH 调整 pH 至 6.0。4 ℃ 保存，可稳定保存 1 个月。

⑩ AO 工作液：加 0.1 ml AO 储存液至 9.9 ml 溶液 B 中，使用当日于冰上配制。EDTA 可以提高 AO 和浓缩样品中 RNA 的结合力。

DNA 和 RNA 的同步流式分析的基本过程可分为如下几步：

1 染色

如下操作应在 0 ℃~4 ℃ 条件下，于一次性玻璃管中进行。

1.1 用 MgCl₂ 浓度为 2 mM 的 PBS 调整细胞悬液浓度为 1.0 × 10⁶ 细胞/ml。细胞用乙醇固定或 Triton X-100 通透处理。

1.2 将溶液 A 和 AO 工作液置于冰上。

1.3 将 0.2 ml 新鲜处理的细胞悬液分装至 12 mm × 75 mm 的 1 次性的玻璃管中。

1.4 加 0.4 ml 溶液 A，0 ℃~4 ℃ 孵育 45 s。

1.5 加 1.2 ml AO 工作液后即刻分析。

1.6 每个样品重复步骤 3~5。

1.7 用漂白剂和蒸馏水冲洗流式细胞仪。

2 分析

2.1 仪器使用和采样

AO 的激发光波长范围为 455~490 nm。因为和 DNA 结合的 AO 的发射光谱与来自 RNA 的红色荧光相重叠，因此联合使用滤光片可以降低这一效应。对于 DNA，我们推荐使用 550-LP 分色滤光片（长通）和 525BP（带通）联用，RNA 推荐使用 630-LP。进一步调节补偿可以降低重叠的激发光。使用过程中需要有标准微球监测仪器的状态，以确定标准微球分辨率与检测通道峰值的一致性。仪器记录散色光信号，DNA/RNA 双参数直方图，以及每一个荧光信号分布的参数。必须要对粘连的细胞进行鉴别。

2.2 RNA 含量标准

通过和具有相同内容物的生物学标准（淋巴细胞，细胞系等等）相比较，可以对 RNA 和 DNA 进行定量。新鲜分离的淋巴细胞是常用的稳定的对照。实验时，应同时设立 RNA 酶处理的和未处理的对照。待测细胞的测量条件必须和对照细胞相同。RNA 的指数以检测样品的 RNA 含量与对照组的 RNA 含量比值表示。淋巴细胞可作为 DNA 含量标准来决定 DNA 指数。

2.3 标准

正常的外周血淋巴细胞（NPBLs）可以用作评价 AO 染色的质量以及二倍体 G₀/G₁，检测通道稳定性的生物学对照。淋巴细胞用 Ficoll-Hypaqu 梯度离心分离液分离后调整细胞浓度为 1 × 10⁶ cells/ml，这个浓度可用于建立一个在 RNA 检测通道上可接受峰值范围。每一组待测样品必须和对照同时染色同时操作。

1. 处理样品前应先准备储存液，AO 工作液需到样品染色的时候现配。

2. 用于配制试剂的所有玻璃器皿都必须无 RNA 酶。

3. 试剂配置的浓度以及 pH 值必须严格准确地按照要求进行。

4. 外周血淋巴细胞和骨髓细胞必须要用 Ficoll-Hypaque 梯度分离液分离实体瘤和骨髓活检必须仔细研碎，以释放单个细胞。

5. 根据血细胞污染的程度，液体和针吸物选择直接用 buffer 洗涤或者用梯度离心分离。

6. 样品应用含有 MgCL₂ 的 PBS 洗涤，并且调整细胞浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/ml。如需检测膜表面分子则无需用含有 MgCL₂ 的 PBS 洗涤。