小鼠流式th17/treg具体步骤？

1、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个.

2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 µl体系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4，0.06 µg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。

3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞（离心并转移）。

4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。

5、避光4℃孵育30分钟到18小时（孵育30分钟到18小时，结果一样）。

6、加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（1:9去离子水稀释）离心洗涤细胞并弃去上清液。

7、重复第6步操作洗涤细胞。

8、（可选）加入含0.5 µg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液，保证100 µl体系4 ℃孵育15分钟。

9、封闭液无需洗去，体系加入0.5 µg PE anti­mouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。

10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

11、重复上一步洗涤细胞。

用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。

1、单细胞悬液制备:将脾脏组织置于铁质滤网,均匀研磨至脾脏细胞充分脱落,用PBS将滤网上粘连的脾脏细胞进行冲洗,收集洗脱下来的脾脏细胞。将小鼠腿骨进行清理,清除肌肉组织,仅留腿骨。用剪刀将小鼠腿骨两端进行剪切,用注射器吸取PBS对小鼠腿骨进行冲洗,直至将骨内髓质完全洗脱为止。将洗脱的髓质均匀研磨,用滤网进行过滤,收集洗脱下来的骨髓细胞。

2、 将制备的单细胞悬液500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

3、 将细胞沉淀用2 mL 溶血素进行重悬,室温反应10 min将红细胞进行裂解。

4、 500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

5、 加入2 mL PBS 将细胞沉淀进行洗涤,重悬后 500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

6、 用1 mL RPMI培养基,吹打混匀重悬细胞。

7、 细胞按1:10或1:20倍稀释,进行细胞计数。

8、 取undefined106个淋巴细胞进行刺激,加入PMA、Ionomycin和Golgistop,37℃培养4 h。

9、 刺激完成后,500 g离心5 min,弃上清。

10、 加入5 mL PBS重悬细胞,500 g离心5 min,弃上清。

11、 加入100 μL PBS重悬细胞,加入APC-CD4抗体1 μL,涡旋混匀,室温避光反应20 min。

12、 每管加2 mL细胞固定液,室温避光孵育20 min,600 g离心5 min,弃上清。

13、 每管加入2 mL细胞破膜液,室温避光孵育10 min,600 g离心5 min,弃上清。

14、 每管加入2 mL细胞破膜液,600 g离心5 min,弃上清。

15、 加入FITC-IL17A 抗体1 uL,涡旋混匀,室温避光孵育30 min。

16、 每管加入2 mL细胞破膜液,600 g离心5 min,弃上清。

17、 每管加入300 uL PBS,涡旋混匀,上机检测。

1. 单个核细胞标本：取200ul 细胞悬液（1640悬液）（含1×106个细胞）。

2. 加入0.4 μl stimulation cocktail，混匀。

3. 37℃，5% CO2 培养箱培养4～6 小时。(不能超过6 个小时)。

4. 混匀，100 µl体系中使用0.125 µg （0.25 ul） FITC anti-mouse CD4。室温，避光孵育30分钟。

5. 分成2管，每管有100μl 已标记好表面抗体的细胞悬液， 编号为A1, A2。

6. 加入2ml PBS离心洗涤细胞（1500 rpm 5 min）并弃去上清液。

7. 旋涡震荡重悬细胞后，加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。

8. 避光4℃孵育30分钟。

9. 加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（1:9去离子水稀释）离心洗涤细胞（1500 rpm 5 min）并弃去上清液。

10. 重复第9步操作洗涤细胞。

11.加入对应抗体

12. 室温，避光孵育30 分钟。每管中加入2mL PBS，1500 rpm 离心5 分钟，弃除上清。

13. 0.5mL PBS 重悬细胞，上机检测