Edman降解的具体步骤

Edman降解是蛋白质测序中一个非常重要的反应步骤，因为通过该反应可以对蛋白质有序的氨基酸组成进行分析。自动化Edman测序仪现在已得到广泛使用，他们能够对长约50个氨基酸的肽进行测序。以下概括了使用Edman降解进行蛋白质测序的步骤，随后还将对其中一些重要步骤做详细说明。
1. 用2-巯基乙醇等还原剂破坏蛋白质中的任意二硫键，过程中可能需要一个保护基团（例如碘乙酸）以防止化学键重新形成；
2. 果蛋白质不止一个，则需要分离并纯化蛋白质混合物中的各条肽链；
3. 确定每条链中的氨基酸组成；
4. 确定每条链末端的氨基酸；
5. 将每条链断裂成50个氨基酸以下的片段；
6. 分离并纯化肽片段；
7. 确定每个肽片段的序列；
8. 使用其他裂解方式重复以上步骤；
9. 构建整条蛋白质序列。

Edman测序实验流程图（来源：百泰派克）

蛋白质裂解成肽片段的过程
长度超过50-70个氨基酸的肽不能通过Edman降解来进行蛋白质测序。因此，需要将长蛋白链裂解成小片段，然后再进行单独测序。裂解过程可以通过内肽酶（例如胰蛋白酶或胃蛋白酶）进行，也可以通过化学试剂（例如溴化氰）进行。不同的酶具有不同的切割模式，片段之间的重叠可用于构建整体蛋白质序列。
Edman反应过程
将待测序的蛋白质吸附到固体表面上。常见的一种基材是涂有聚丁二烯(一种阳离子聚合物)的玻璃纤维。将Edman试剂苯基异硫氰酸酯（PITC）与12％三甲胺的弱碱性缓冲溶液一起添加到吸附的蛋白质中，将所得物与氨基酸N端的胺基进行反应。
然后通过添加无水酸来选择性地分离末端氨基酸。接着，该衍生物异构化，得到替代物苯基硫代乙内酰脲。洗掉该替代物并通过色谱法鉴定，重复整个循环。每个步骤的效率约为98％，能有效地鉴定约50个氨基酸。
蛋白质测序仪的使用
蛋白质测序仪是一种以自动化方式执行Edman降解的机器。将蛋白质或肽的样品固定在蛋白质测序仪的反应容器中，进行Edman降解。每个循环从蛋白质或肽的N端释放并衍生一个氨基酸，然后通过HPLC鉴定生成的氨基酸衍生物。对整个多肽重复进行测序过程，直到测定了完整的可测量序列或提前设定的循环次数为止。