trizolRNA提取的具体步骤有哪些？

称取组织约50mg置于2mLEP管中，剪碎；加入Trizol试剂1mL，匀浆器研磨成浆，移入新的1.5mL EP管中，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，冰上静置5min，4℃ 15000g离心15min；吸取上层透明液体至新开启1.5mL EP管，加入500μL异丙醇，轻轻上下颠倒两次混匀，-20℃冰箱静置30min，4℃ 15000g离心15min；加入200μL 75%乙醇洗涤沉淀两次，4℃ 15000g离心15min；弃上清，将EP管倒扣于洁净吸水纸上，室温晾干，加入适量DEPC水溶解沉淀，轻轻振荡混匀，置于冰上待用。

1）取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm ，离心5min，弃上清

a 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中

b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次

2）1ml Trizol Reagent，震荡混匀

3）将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

4）可选步骤:4 ℃ 12 000rpm离心10min，取上清。

5）每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。

6）4 ℃ 12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。

7）在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放置20-30min。

（植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。）

8）4 ℃ 12 000rpm离心10min，去上清。

（离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。）

9）加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来，每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

10）4 ℃ 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

11）室温放置晾干（晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50度保温1小时。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺。溶解，-70℃保存。可以分装保存，防止污染，

12）取1ul+1ul buffer 电泳检测RNA完整性，稀释一定倍数，分光光度计测定纯度和浓度。

1、组织匀浆

(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离

加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心 12,000× g，15 minutes ， 2 - 8°C。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀

将上层水相转移到另一干净的EP管中， 加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes， 2 - 8°C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤

去上清， 加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解

去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。

用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60°C。测浓度后-20°C保存。

6、测浓度

7、RNA鉴定