请问Trizol法提取RNA需要注意些什么？

（1）提前准备好试剂：三氯甲烷（氯仿），异丙醇，75℅乙醇（需要4°C预冷），无RNase的水、Trizol reagent。

（2）准备好枪头和EP管，注意需提前做好高温灭菌，或使用无RNase的枪头和EP管。

（3）离心机先进行4度预冷。

（4）实验需要在超净工作台中进行，实验开始前打开超净台紫外灯15min以上，并用酒精擦拭台面进行消毒；

（5）全程穿好白大褂，带好口罩和手套，一方面放置污染，一方面也是保护自己；注意回到超净台时，双手用酒精消毒。

（6）配置溶液，尤其是溶解RNA时，使用无RNase的水。

（7）匀浆时如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

（8）加氯仿后，样品会被分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，吸取水相时一定要注意不能吸到其他部分。

操作台面酒精消毒，带好手套、口罩和白大褂，尽量在冰上操作

1.从少量的组织(1—10 mg)或细胞(102—104)中分离RNA 样品：往组织或细胞中加入800 祃 TRIZOL。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前，加入5—10μg无RNA酶的脂质体(Cat.No 10814)作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。脂质体会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4 mg/ml之前它不会抑制第一丝状体的合成也不会抑制PCR。

2.在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（步骤4，RNA洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5到–20°C下至少可保存一年。

3.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作，低温可以避免脆弱的RNA被降解。

1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 ℃放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 ℃长期保存。

预防RNase污染，应注意以下几个方面：

1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。