免疫组化具体步骤中的一些问题

问题：我现在刚开始做石蜡切片免疫组化，具体操作过程中有些问题想要咨询一下

1.脱蜡至水：二甲苯I II 各10分钟后 100% 95% 85% 75%酒精各多久呢(因看各个版本的介绍都不同)

2.只搞一个浓度的酒精如95%时间稍微长一些可以吗？

3.抗原修复：可以枸橼酸加热至沸腾再放入切片保温5-10分钟吗?冷却至室温这步可以将切片拿出来冷吗?

4.加一抗后37度2-3小时这步要怎么操作,切片怎样放在水浴箱呢?

5.DAB用前几天的可以吗?一定要现用现配吗?

6.苏木精复染要几分钟呢?弱弱的问一下这步的作用是什么?

7.另外听说这步完了在透明之前要在稀盐酸中过一下有这种说法吗?作用是什么呢?

答：

针对脱蜡问题：
以后各5分钟,最好是搞两个浓度的酒精,如95%,因为用久了就会稀释.
脱蜡的时候酒精的浓度要从高向低，我一般是二甲苯－－二甲苯－－100％酒精－－100％酒精－－95％酒精－－80％酒精

针对抗原修复问题：
抗原修复比较重要，一般是在90度以上15分钟，先把片子放进去然后加热，15分钟后最好让其自然冷却，也可以将抗原修复的容器放在一盆冷水里，让其环境冷却后再将片子拿出来。

我是这样做的:微波（MW）加热过程如下：在专用盒内放入200ml柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，采用微波炉中等功率800W,微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(建议用医用微波炉)，中档继续处理10-20分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟。

经高温后冷却这一步不能省略.个人观点，15分钟的冷却是必须的：

（1）如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。

（2）突然从高温到低温可导致组织片掉片。

（3）可能引起形态学的变化。(所以不要拿出来呀)

针对第四个问题：
我一般一抗孵育都是放在4度冰箱里过夜

针对第五个问题：
DAB要现配现用，在30分钟内用完，我一般DAB显色30秒，效果还可以，但具体情况还是要具体分析，在显微镜下看情况而定，但是如果超过10分钟都没有颜色的话就说明染色失败了

针对第六个问题：
苏木素是染细胞核的，我一般染 1 分钟，复染时间不等,有的30S,有的几分钟,根据组织,你自己多做几张摸索一下.作用是染细胞核.

针对第七个问题：
复染后，在透明之前可以用 1％酒精盐酸分化，通过改变其PH值来分化胞浆的颜色。然后用淡氨水返蓝。如果复染太深了,你可以分化,一般不用.

说道最后：
如果你的片子一直不出结果，先看看自己的操作有没有问题，二抗是不是针对一抗来源的特异性抗体，如果操作各步骤都没有问题，最先考虑的就是一抗的问题。