2D 凝胶的蛋白 Edman 测序
丁香园
1450
1. 前言
如能通过电转移或其他相关技术将蛋白样品从凝胶相有效转移到适合于气相测序 ( gas-phase sequencing) 的其他介质上时，则 2D 凝胶分离的蛋白可进行 Edman 测序 [1] 。首先，皮摩尔数量级的蛋白通过 2D-PAGE 分离 [2]，然后经电转移从 2D-PAGE 凝胶上转移到 PVDF 膜上，再通过 Edman 测序法进行蛋白质的氨基酸测序。蛋白质 N 端顺序测定法—— Edman 降解是非常灵敏的测序方法（只需 1~5 μg 的蛋白质）。但是当出现缺口或模糊序列时，可以通过其他的方法来确认序列，而这往往需要更多的材料。
蛋白往往会进行翻译后修饰。N 端肽段封闭是较为常见的蛋白修饰之一。蛋白 N 端封闭既可以在体内也可在体外进行。但蛋白质抽提、2D-PAGE 和印迹可以防止这种 N 端封闭。使用非常纯的试剂，在抽提缓冲液、电泳和电转移缓冲液中加入自由基清除剂——巯基乙酸和进行预电泳以去除凝胶中的自由基清除剂都能有效阻止体外蛋白 N 端肽段的封闭 [3] 。然而，如果蛋白质的 N 端肽段在体内已封闭，则需用化学试剂、酶去封闭程序或者肽图谱程序来确定蛋白 N 端或内部的序列。
如能通过电转移或其他相关技术将蛋白样品从凝胶相有效转移到适合于气相测序 ( gas-phase sequencing) 的其他介质上时，则 2D 凝胶分离的蛋白可进行 Edman 测序 [1] 。首先，皮摩尔数量级的蛋白通过 2D-PAGE 分离 [2]，然后经电转移从 2D-PAGE 凝胶上转移到 PVDF 膜上，再通过 Edman 测序法进行蛋白质的氨基酸测序。蛋白质 N 端顺序测定法—— Edman 降解是非常灵敏的测序方法（只需 1~5 μg 的蛋白质）。但是当出现缺口或模糊序列时，可以通过其他的方法来确认序列，而这往往需要更多的材料。
蛋白往往会进行翻译后修饰。N 端肽段封闭是较为常见的蛋白修饰之一。蛋白 N 端封闭既可以在体内也可在体外进行。但蛋白质抽提、2D-PAGE 和印迹可以防止这种 N 端封闭。使用非常纯的试剂，在抽提缓冲液、电泳和电转移缓冲液中加入自由基清除剂——巯基乙酸和进行预电泳以去除凝胶中的自由基清除剂都能有效阻止体外蛋白 N 端肽段的封闭 [3] 。然而，如果蛋白质的 N 端肽段在体内已封闭，则需用化学试剂、酶去封闭程序或者肽图谱程序来确定蛋白 N 端或内部的序列。
