基本方案 手工EDMAN降解法

1. 根据候选肽段的列表确定循环数。

将循环数指定为^每一循环的起始体积为 20 μl。

2. 在称为反应管（微量离心管）的管子中将洗脱的肽溶解于 20 μl 去离子水中。

3. 取 20/（x+1）μl 的一份样品到一新的管子中；此为起始样品材料，储存于 4℃。

4. 补加去离子水到反应管中，使总体积恢复到 20 μl。此时开始对样品进行计数：

4.1 确保从起始样品中实际取出所需的 cpm 量（作为起始样品材料）；

4.2 在每一循环开始时检测 cpm。

5. 每个反应管中加入 20 μl 5%（V/V）异硫氰酸苯酯（溶于吡啶中），充分涡旋振荡混匀，短暂离心收集液体至管底，45℃ 孵育 30 min。

6. 每个反应管中加入 200 μl 10:1 庚烷/乙酸乙酯，涡旋振荡 15 s。全速离心 1 min 分离两相。

吡啶会进入有机相（上层）。

7. 用带塑料吸头的移液器，小心吸去上层有机相。按步骤 6 的方法用 10:1 庚院/乙酸 乙酯再次抽提水相（下层）。

8. 按步骤 6 的方法用 2:1 庚烷/乙酸乙酯抽提水相 2 次。

9. 在干冰上冷冻水相，然后在 SpeedVac 蒸发器中冻干。

10. 将干的样品重新溶解于 50 μl 100% 三氟乙酸（TFA），45℃ 孵育 10 min。

11. 在 SpeedVac 蒸发器中冻干样品。

12. 用契仑科夫计数法对样品计数。

测得的 cpm 应当与循环开始时的值（即步骤 4）相同。

13. 往反应管中加入 20μl 去离子水，涡旋振荡，短暂离心。取出 20/x μl 第一个循环的产物用于分析。取出的样品与起始样品一起储存于 4℃。

14. 补加去离子水到反应管中，使总体积恢复到 20μl，开始第二轮反应。重复步骤 5~12。

15. 第二轮反应后，加 20μl 去离子水重悬剩余的样品，取出 20/（x -1）μl 转移到新的管中作为第二轮产物以待分析。重复步骤 4~12。

16. 继续重复步骤 4~12 的操作，直至进行到所需的反应轮数。

对于每一新的循环，所取的样品量为 2（x-y）μl，此处 y 等于循环轮数减去 1。

17. 将所有样品在 SpeedVac 蒸发器中冻干。用契仑科夫计数法对所有的最终样品进行计数。

18. 如果进行了冻干，用 5μl pH 1.9 的电泳缓冲液或去离子水溶解样品。以最大速度离心 2 min 以沉淀不溶的物质。

如果每轮反应后所取样品的体积很少，可以跳过步骤 17 和 18，将样品直接上样到 TLC 平板上。

19. 将分析一个既定的磷酸肽的所有样品以至少 1 cm 的间距点样于 TLC 平板中心的一条垂直线上的起始点（见图 17.9.5）。将 50~200 cpm [32P] 磷酸盐或 1~2 μg PTH-磷酸酪氨酸（0.5~1.0 μl 2 mg/ml PTH-憐酸酪氨酸储液）（取决于所研究的 肽的磷酸氨基酸的组成）作为标记点样于位于同一垂直线上的起始点。点样时每次滴加 1/3~1/2 μl 样品，干燥后再滴加下一滴（见基本方案 1 步骤 25）。

20. 如图 17.9.5，浸湿平板。

21. 准备 HTLE7000 装置，以 1.0 kV 电压在 pH 1.9 的电泳缓冲液中电泳 25 min（见基本方案 1 和图 17.9.3）。

22. 待平板干燥后（用 65℃ 烘箱或风扇），用放射性或荧光标记物进行标记，在增感屏 的辅助下于 -70℃ 对预敏化的胶片曝光（放射自显影）。