Maxam-Gilbert 化学降解法

1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的测定方法，其原理为：将一个 DNA 片段的 5' 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基（表 6-1），从而产生一系列长度不一而 5' 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 Maxam-Gilbert 化学降解法测序原理如图 6-1 ：

表6-1：Maxam-Gilbert 化学降解法测序的常用化学 试剂 ：

碱基体系	化学修饰 试剂	化学反应	断裂部位
G A + G C + T C A > C	dimethyl sulphate（硫酸二甲酯） Piperidine formate（哌啶 甲酸）, pH2.0 hydrazine（肼，联氨NH2 .NH2 ） hydrazine + NaCl（1.5M） 90°C, NaOH（1.2M）	甲基化 脱嘌呤 打开嘧啶环 打开胞嘧啶环 断裂反应	G G和A C和T C A和C

硫酸二甲酯[dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3 O）2 SO2 ]是一种碱性化学试剂，可以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化，但是鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中性 pH 环境中， DMS 主要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖苷键断裂。

哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致 DNA 链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。

肼，又称联氨 NH2 .NH2 ，在碱性环境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH），肼则主要作用于胞嘧啶 C ，使之断裂。

作为标记用的放射性同位素主要有 γ-32 Ｐ（[γ-32 Ｐ]ATP，[γ-32 Ｐ]GTP. [γ-32 Ｐ]TTP ，或[γ-32 Ｐ]CTP），或 γ-33 NTP ， S-35 NTP 。

Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G ， C 含量较高的 DNA 片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。

化学降解测序法既可以标记 5'-末端，也可以标记 3'-末端。如果从两端分别测定同一条 DNA 链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的 DNA 链序列。

(责任编辑：大汉昆仑王)