细胞铺板（详细步骤）

细胞铺板是细胞实验中常见又必须的实验操作，在细胞计数、培养、免疫荧光等实验操作中必不可少。主要是根据实验目的将一定浓度的细胞稀释液无污染地接种到细胞计数板中，方便进行下一步操作。

用于细胞计数、迁移、侵袭实验等。

75% 的酒精、酒精棉球、超净台、倒置显微镜、酒精灯、移液枪、枪头、PBS 液、0.25% 胰酶、培养皿、含 5% 血清的新鲜培养基、15 mL 离心管、离心机。

1、准备工作：实验前，提前 30 分钟打开超净台，打开水浴锅，37 ℃ 预热培养基、PBS 以及胰蛋白酶。紫外照射 30 min 后：

① 75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台；

② 将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）；

③ 倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。

2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。沿无细胞的壁加入 5 mL PBS 液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。

3、将 0.25% 胰酶 600 uL 加入培养皿内，上下左右铺匀，37 ℃ 消化，细胞系大约消化 1 min，原代细胞消化 5 min 左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全。

4、加入 4 mL 的含 5% 血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到 15 mL 离心管中。1000 rpm 离心 3 min。

5、弃上清。用 3 mL PBS 洗细胞，吹打混匀，洗 2 次，1000 rpm 离心 3 min，弃上清。

6、细胞沉淀中加 3 mL 5% 血清的新鲜培养基，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。

7、移液枪吸取 15 µL 细胞悬液，沿盖玻片边缘将细胞悬液缓慢充满盖玻片和计数板之间，注意盖片不要有气泡。计算四大格细胞计数总数，对于压线细胞，技术原则为计上不计下，计左不计右。计算公式：细胞数 / mL = 四大格细胞总数 / 4×104。

8、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。

1、细胞板子不需要提前用培养基润洗，直接从边上滴入混有细胞的培养基；

2、放置 30 s~1 min 后，前后摇晃 5~8 次；

3、放在水平台上静置 2~5 min，后放入孵箱。

4、因为有些细胞刮刀不好用，没有办法刮到周围的，一般在提取蛋白或者提取 RNA 的时候有时会想要铺中间多，周围少的板子，手法如下：细胞板子不需要提前润洗，从中间滴入进去后；然后，把板子朝一个方向顺时针或者逆时针旋转 3~5 圈；再在水平台上静置 2~5 min；最后放入孵箱。

5、细胞计数前后出现较大误差考虑细胞沉降导致悬液不匀；悬液体积过大或过小；稀释倍数太高或太低等原因造成。

6、尽量将细胞吹打为单个，防止抱团，且用移液枪充分吹打，使其均匀悬浮在培养基中。

7、由于加入计数室的量，过少会导致计数室内出现气泡，过多则会使得计数板上的盖玻片不紧贴计数板，使得高度变高，体积变大；计数室体积为 9 mm³，所以一般加 15 uL 左右。

8、计数时，细胞稀释倍数一般最适浓度为 5~10×10⁵ 细胞 / mlL。如一般 10 cm 皿的细胞约 300~500 万个，一些细胞个体小也能达到 1000~2000 万，可根据所需细胞数目取出部分作稀释或连续稀释后计数。