细胞铺板

单细胞铺板是将细胞培养板的每个孔中预先加入适量完全培养基，充分晃动使培养基浸润整个孔底，随后滴加重悬好的细胞悬液，充分摇晃混匀，将细胞分散，不抱团也不过分空荡。

DMEM 培养基、无菌 PBS、0.25% 胰蛋白酶

移液器、无菌枪头、无菌 EP 管、6 孔细胞培养板、细胞计数板

（1）细胞培养一段时间，选择生长状态良好且处于对数生长期的细胞；

（2）弃去旧培养基，PBS 轻柔润洗 3 次；

（3）弃 PBS，加入 1 mL 0.25% 的胰蛋白酶，覆盖住细胞为宜；

（4）置于细胞培养箱孵育 2 min 左右，充分消化细胞；

（5）取出细胞，置于显微镜下观察，摇晃培养皿见细胞缩小变圆且轻微浮动即可及时终止，加等量的完全培养基终止消化；

（6）轻柔混匀，1000 rpm 离心 5 min，弃上清；

（7）完全培养基重悬细胞，细胞计数后按 6-8×10⁵ 个/孔接种于 6 孔细胞培养板中，每孔已提前加好 1 mL 完全培养基，轻柔混匀，置于细胞培养箱中培养。

（1）实验前 30 min 对细胞间及超净台进行充分紫外照射；

（2）进入细胞间更换无菌衣，无菌拖鞋等；

（3）细胞接种密度 6-8×10⁵ 个/孔，需要根据孔板大小而定，以铺至孔的 60~70% 为宜；

（4）胰蛋白酶消化的时间依据细胞类型而定，最初实验需要设置时间梯度摸索；

（5）加培养基要充分混匀，保证细胞分布均匀，而不会一处多一处少呈现抱团现象。