流式细胞术鉴定树突状细胞步骤？

BMDC流式表型检测步骤：

1. 细胞获得
1.1 小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；
1.2 将骨移至超净台内，并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的PBS 洗2 次；
1.3 将骨移入另一个盛有PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨完全变白；
1.4 收集骨髓悬液，用200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织；
1.5 滤过液1200 rpm 离心5min，弃上清；
1.6 加入2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育3-5min，最长10min；

2.诱导分化

2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为0.5-1 x 106/ml；
2.2 铺至24 孔培养板内，每孔1ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养，此为培养的第0 天；
2.3 每2 天轻轻摇晃培养板，然后3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
2.4 在第5 天和第8 天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞；
2.5 1200 rpm 离心5min，弃上清；
2.6 用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至1 x 106/ml，并加入重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)；
2.7 细胞铺板至100 mm 培养皿(每皿最多10ml)或6 孔培养板(2m/孔)。
2.8 37℃，5% CO2 培养箱继续培养1-2 天；
2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的BMDC。

3. BMDC 的完全成熟
3.1 步骤2.4 或2.9 中获得的BMDC 以1200rpm 离心5min，弃上清；
3.2 用含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI 完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为1 x 106/ml；
3.3 加入24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等；
3.4 37℃，5% CO2 培养箱培养2 天；
3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。

树突状细胞的检测

1、五色分析DC表达:CD(14+16)-FITCCD85k(ILT3)-PECD45- ECD，CD33-PC5，CD2-PC7。

2、同时检测和区分MDC和PDC

1.五色分析DC表达

2.同时检测和区分MDC和PDC

3.PBMC加入诱导未成熟DC表型

4.加入TNF诱导成熟