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最近需要做BMDC流式表型检测,大致的操作我清楚,但我们学院没有师兄师姐做过这块,所以想问一下大家有没有实验步骤文献推荐感谢!具体的步骤,怎么加抗体也想学习一下!
土井挞克树
BMDC流式表型检测步骤:
1. 细胞获得
1.1 小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死,手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias),并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净;
1.2 将骨移至超净台内,并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5min,以消毒灭菌,然后用无菌的PBS 洗2 次;
1.3 将骨移入另一个盛有PBS 的新培养皿中,用剪刀剪去骨两端,再用注射器抽取PBS,针头分别从骨两端插入骨髓腔,反复冲洗出骨髓至培养皿中,直至骨完全变白;
1.4 收集骨髓悬液,用200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织;
1.5 滤过液1200 rpm 离心5min,弃上清;
1.6 加入2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x),重悬细胞,室温孵育3-5min,最长10min;
2.诱导分化
2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为0.5-1 x 106/ml;
2.2 铺至24 孔培养板内,每孔1ml 细胞,同时加入重组小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml),37℃,5% CO2 培养箱培养,此为培养的第0 天;
2.3 每2 天轻轻摇晃培养板,然后3/4 体积更换新鲜培养液,并补足细胞因子。
2.4 在第5 天和第8 天之间,轻柔吹打培养液,收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞;
2.5 1200 rpm 离心5min,弃上清;
2.6 用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数,然后调整细胞浓度至1 x 106/ml,并加入重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml);
2.7 细胞铺板至100 mm 培养皿(每皿最多10ml)或6 孔培养板(2m/孔)。
2.8 37℃,5% CO2 培养箱继续培养1-2 天;
2.9 收集悬浮细胞,即为较成熟的BMDC。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 步骤2.4 或2.9 中获得的BMDC 以1200rpm 离心5min,弃上清;
3.2 用含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI 完全培养液重悬沉淀,计数后调整细胞浓度为1 x 106/ml;
3.3 加入24 孔培养板中,并加入成熟诱导剂,如TNF-α (250U/ml),LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等;
3.4 37℃,5% CO2 培养箱培养2 天;
3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。
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树突状细胞的检测
1、五色分析DC表达:CD(14+16)-FITCCD85k(ILT3)-PECD45- ECD,CD33-PC5,CD2-PC7。
2、同时检测和区分MDC和PDC
秋秋欣欣
1.五色分析DC表达
2.同时检测和区分MDC和PDC
3.PBMC加入诱导未成熟DC表型
4.加入TNF诱导成熟