标准菌株验证鉴定步骤
海博生物
15509
菌种活化：干粉标准菌株 标准贮备菌株 工作菌株；
1.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌标准菌株：
挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃ 培养18-24 小时。并观察菌落形态。
a. 金黄色葡萄球菌：菌落凸起，圆形，不透明；
b. 大肠埃希氏菌：菌落稍凸，圆形，湿润，乳白色；
c. 铜绿假单胞菌：菌落扁平，圆形，边缘不整齐，光滑湿润，可产生蓝绿或黄绿色素；
d. 枯草芽孢杆菌: 表面粗糙不透明，镜检菌体有芽孢。
1.2 白色念珠菌：
挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂培养基平板或PDA 琼脂平板上，30℃-35℃ 培养24-48 小时。本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
黑曲霉：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃-28℃ 培养48-96 小时。菌丛呈黑褐色，粗糙。
1.2 生孢梭菌：
挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃ 培养18-24 小时；或在厌氧条件下接种于哥伦比亚琼脂上，30℃～35℃ 厌氧培养18-24 小时。
2、菌种鉴定：
2.1 金黄色葡萄球菌：
革兰氏染色试验：革兰氏阳性菌(紫色)，葡萄状排列，球菌。
兔血浆试验：接种1 个单菌落于1 支兔血浆溶液中，30℃-35℃ 培养至6 小时，每半小时观察一次。凝固为阳性。金黄色葡萄球菌为阳性反应。
2.2 大肠埃希氏菌：
革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色。
IMVC 生化试验：
2.3 铜绿假单胞菌：
革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色A。
氧化酶试验：将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，涂在试纸上。在60s 内变为蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。
绿脓菌素试验：取斜面培养物接种于PDP 琼脂培养基斜面上，培养24 小时，加三氯甲烷3～5 ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L 盐酸试液约1 ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。本菌为绿脓菌素试验阳性。
荧光试验：接种于金氏B 培养基(或假单胞菌产荧光色素培养基) 上，36℃±1℃ 培养18-24 小时，在366nm 紫色灯下有蓝绿色荧光。
2.4 枯草芽孢杆菌：
菌落形态：表面粗糙不透明，有皱摺。
镜检：用芽孢染色液染色，菌体有芽孢。
2.5 白色念珠菌：
革兰氏染色试验：呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
念球菌显色培养基：30-35℃ 培养24-48 小时，呈绿色菌落。
产芽管试验：挑取1% 吐温80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3 小时，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。
2.6 黑曲霉：
23℃-28℃ 培养48-96 小时。菌丛呈黑褐色，粗糙，有黑色孢子产生。
2.7 生孢梭菌：
革兰氏染色试验：革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢。
哥伦比亚琼脂培养基试验：接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48～72 小时，应生长。
过氧化氢酶试验：滴加3% 过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。本菌为阴性反应。
3、需购买试剂：
1.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌标准菌株：
挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃ 培养18-24 小时。并观察菌落形态。
a. 金黄色葡萄球菌：菌落凸起，圆形，不透明；
b. 大肠埃希氏菌：菌落稍凸，圆形，湿润，乳白色；
c. 铜绿假单胞菌：菌落扁平，圆形，边缘不整齐，光滑湿润，可产生蓝绿或黄绿色素；
d. 枯草芽孢杆菌: 表面粗糙不透明，镜检菌体有芽孢。
1.2 白色念珠菌：
挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂培养基平板或PDA 琼脂平板上，30℃-35℃ 培养24-48 小时。本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
黑曲霉：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃-28℃ 培养48-96 小时。菌丛呈黑褐色，粗糙。
1.2 生孢梭菌：
挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃ 培养18-24 小时；或在厌氧条件下接种于哥伦比亚琼脂上，30℃～35℃ 厌氧培养18-24 小时。
2、菌种鉴定：
2.1 金黄色葡萄球菌：
革兰氏染色试验：革兰氏阳性菌(紫色)，葡萄状排列，球菌。
兔血浆试验：接种1 个单菌落于1 支兔血浆溶液中，30℃-35℃ 培养至6 小时，每半小时观察一次。凝固为阳性。金黄色葡萄球菌为阳性反应。
2.2 大肠埃希氏菌：
革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色。
IMVC 生化试验：
2.3 铜绿假单胞菌：
革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色A。
氧化酶试验：将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，涂在试纸上。在60s 内变为蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。
绿脓菌素试验：取斜面培养物接种于PDP 琼脂培养基斜面上，培养24 小时，加三氯甲烷3～5 ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L 盐酸试液约1 ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。本菌为绿脓菌素试验阳性。
荧光试验：接种于金氏B 培养基(或假单胞菌产荧光色素培养基) 上，36℃±1℃ 培养18-24 小时，在366nm 紫色灯下有蓝绿色荧光。
2.4 枯草芽孢杆菌：
菌落形态：表面粗糙不透明，有皱摺。
镜检：用芽孢染色液染色，菌体有芽孢。
2.5 白色念珠菌：
革兰氏染色试验：呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
念球菌显色培养基：30-35℃ 培养24-48 小时，呈绿色菌落。
产芽管试验：挑取1% 吐温80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3 小时，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。
2.6 黑曲霉：
23℃-28℃ 培养48-96 小时。菌丛呈黑褐色，粗糙，有黑色孢子产生。
2.7 生孢梭菌：
革兰氏染色试验：革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢。
哥伦比亚琼脂培养基试验：接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48～72 小时，应生长。
过氧化氢酶试验：滴加3% 过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。本菌为阴性反应。
3、需购买试剂：
| 菌株 | 培养基及试剂 |
| 金黄色葡萄球菌 | HB8278革兰氏染色液试剂盒、HB4117 兔血浆、HB0109-7营养琼脂培养基 |
| 大肠埃希氏菌 | HBIG13 HBI大肠杆菌生化鉴定条、HB8280甲基红试剂盒、HB8281 V-P试剂盒、HB8279 Kovacs氏靛基质试剂盒 |
| 铜绿假单胞菌 | HB5187绿脓菌素测定培养基(PDP）、HB2100氧化酶试纸、HB8484假单胞菌产荧光色素培养基 |
| 枯草芽孢杆菌 | HB8300芽孢染色液 |
| 白色念珠菌 | HB7015念球菌显色培养基、HB0236-1 1%吐温80-玉米琼脂培养基 |
| 黑曲霉 | HB4701改良马丁琼脂培养基 |
| 生孢梭菌 |
HB0124-1哥伦比亚琼脂培养基、HB0124-1a硫酸庆大霉素(4mg/支)、 HB8650 3%过氧化氢试液 |
