简介
细胞因子流式细胞术（Cytokineflowcytometry，CFC）是指应用抗细胞因子抗体来分析作为细胞活化标志细胞因子的流式细胞术的统称。此技术最常见的应用是对经体外短时间活化并固定和通透的细胞进行细胞内细胞因子的标记。当用特异抗原刺激时，此技术可以对稀有的抗原特异的 T 细胞进行定量分析。
原理
细胞因子流式细胞技术的原理是用蛋白或多肽抗原或丝裂原在分泌抑制剂存在的情况下进行短期体外活化，用 EDTA 处理以终止活化并去掉粘连细胞，然后固定，用荧光标记的抗体染色，数据用流式细胞仪进行分析，结果通过对感兴趣的细胞群进行设门分析（如 CD3+ CD8+ 淋巴细胞）。
材料与仪器
器材：
① 96 孔锥形底深孔聚烯板及盖子（BDDiscoveryLabware，Bedford，MA）（适合于全血分析）
② 96 孔圆底标准聚苯乙烯组织培养板及盖（适用于 PBMCs 分析）
③ 12 道微量移液器（35 mm 的用于全血，7 mm 的用于 PBMCs）
④ 持板器
⑤ 可离心深孔板的离心机（如 Sorvall Instruments，Newtown，CT）
⑥ 流式细胞仪
⑦ 流式 96 孔板上样装置
试剂：
① 肝素化的全血或 PBMCs
② RPMI-1640 培养基
③ 20 mM HEPES
④ 10％ 胎牛血清
⑤ 抗生素/抗真菌素溶液（cRPMI-10）
⑥ 共刺激抗体（CD 28 和 CD 49d）
⑦ 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）中
⑧ BrefeldinA 储存液
⑨ 二甲基亚砜（DMSO）
⑩ EDTA
⑪ 红细胞裂解液和细胞固定液
⑫ 细胞通透试剂
⑬ 荧光标记抗体
⑭ 0.5％ 牛血清白蛋白
⑮ 0.1％ 叠氮钠
⑯ 固定液
步骤
1. 样品收集
（1） 对于全血分析：肝素钠抗凝收集全血保存于室温，不要长于 8 h；
（2） 对新鲜的 PBMC 分析：用 Ficoll 梯度方法或其他商业化方法（如 CPTTM 管，BD Vacu-tainer，Franklin Lakes，NJ）分离 PBMCs。将 PBMCs 重悬，浓度在 2.5 × 106 到 1× 107 个活淋巴细胞/mL；
（3） 对冻存的 PBMC 分析：37 ℃ 水浴快速融化 PBMCs，用预热的 cRPMI-10 培养基缓慢稀释到 10 mL 250 g 离心 7 min。用预热的 cRPMI-10 小体积重悬细胞，用台盼蓝染色计数细胞活率，并稀释到终浓度 2.5 × 106 到 1 × 107 个活淋巴细胞/mL；
（4） 在 96 孔板中每孔滴加 200 μL 全血或 PBMCs。对于全血或新鲜的 PBMC 分析，直接按小标题 2 处理。对于冻存的 PBMC 分析，在刺激前 37 ℃ 孵育过夜（12~18 h）。
2. 活化细胞
（1） 溶解肽类或其他抗原及 Brefeldin A。用 PBS 按 1:10 稀释肽储存液和 5 mg/mL brefeldin A 储存液；
（2） 给每个活化抗原配置刺激物混合液备用。一般「试剂混合液」要稍过量（例如，刺激 18 个孔，准备足够 20 个孔的「试剂混合液」）；
（3） 吸 20 μL 试剂混合液到每孔细胞中，按小标题 1 描述的用移液器轻轻抽吸混匀；
（4） 盖上培养板 37 ℃ 孵育 6 h。
3. 样品
全血（深孔板）
（1） 活化之后，加 20 μL 20 mM EDTA/PBS 到每孔中，用移液器抽吸混匀；
（2） 室温孵育 15 min，用力抽吸混匀；
（3） 每孔加 1.5 mL 室温 1 × BD FACS 裂解溶液，室温孵育 10 min；
（4） 500 g 离心 5 min。用 35 mm 的真空吸液器吸去上清，用剩余的液体抽吸重悬沉淀；
（5） 每孔加 1 mL 室温 1 × BD FACS 通透液，室温孵育 10 min；
（6） 每孔加 0.5 mL 洗液，离心培养板 500 g 5 min，用 35 mm 真空吸液器吸去上清；
（7） 每孔加 1.5 mL 洗液，按上述方法离心，吸除上清；
（8） 用适度滴度的染色抗体混合液重悬沉淀（如抗 IFN-γ FITC/CD69 PE/CD8 PerCP-Cy5.5/CD3 APC）。室温避光孵育 60 min，每 15~20 min 吹打混匀一次；
（9） 每孔加 1.5 mL 洗液，500 g 离心培养板 5 min，用 35 mm 真空吸液器吸去上清；
（10） 用 150 μL 1％ 多聚甲醛/PBS 重悬细胞，24 h 内 4 ℃ 避光保存直到获取数据。
PBMC（标准板）
（1） 每孔加 20 μL 20 mM EDTA/PBS，用移液器轻轻抽吸混匀；
（2） 室温孵育 15 min，用移液器抽吸充分混匀；
（3） 250 g 离心培养板 5 min，用 7 mm 的真空吸液器吸去上清；
（4） 每孔加 100 μL 1 × BD FACS 裂解液重悬细胞，室温孵育 10 min；
（5） 每孔加 100 μL 洗液，之后 500 g 离心 5 min。用 7 mm 的真空吸液器吸去上清；
（6） 每孔用 200 μL 1 × BD FACS 通透液 2 重悬细胞沉淀，室温孵育 10 min；
（7） 500 g 离心 5 min，用 7 mm 的真空吸液器吸去上清；
（8） 每孔加 200 μL 洗液，500 g 离心培养板 5 min，用 7 mm 的真空吸液器吸去上清；
（9） 每孔再加 200 μL 洗液，同步骤 8 离心，弃上清（在加抗体之前多洗几次是必要的，以去除残留的通透液）；
（10） 用适量滴度的抗体混合液重悬细胞沉淀（例如，抗 IFN-γFITC/CD69 PE/CD8 Per-CP-Cy5.5/CD3 APC）。室温避光孵育 60 min，每 15~20 min 吹打混匀一次；
（11） 每孔加 200 μL 洗液，500 g 离心培养板 5 min，用 7 mm 的真空吸液器吸去上清。
（12） 每孔再加 200 μL 洗液，同步骤 11 离心，弃上清；
（13） 用 150 μL 1％ 多聚甲醛/PBS 重悬细胞沉淀，24 h 内 4 ℃ 避光保存直到获取数据。
4. 数据获取和分析
（1） 手动或用荧光微球和软件校准流式细胞仪；
（2） 手动校准：用同型对照混合液染色的样品设定每个光电倍增管（PMT）的值，用单标记每个荧光素的样品设定补偿值；
（3） 用磁珠校准：根据厂商推荐来调设（例如，用 BD FACSComp 软件选 Lyse No Wash 和 BD CalibriteTM 微球）进行设置；
（4） 设置合适的前向散射的阈值以消除细胞碎片并保留淋巴细胞群。如果需要，在 CD3＋ 细胞群中设第二道阈值以消除非 T 细胞并减小文件的大小；
（5） 设置收集标准使得每个门收集大约 40000 个细胞（如，CD4+ 或 CD8＋ T 细胞）。当用自动化上样板时，设置次级收集时间标准，以免样品被抽干。例如，在 BD FACS CaliburTM 上高速收集 200 μL 样品，设置收集时限最大为 180 s；
（6） 在收集几个样品之后存储收集模板和机器参数以校验设置和设门；
（7） 如果可行的话，输入所有合适的信息到自动上样软件中；
（8） 获得数据；
（9） 分析数据，通过前向和侧向散射来圈定小的淋巴细胞区并用合适的试剂圈定对应的其他细胞群（例如，CD3+ CD8＋ 细胞）。注意适当设置这些区域的尺寸，要包括因活化而导致 CD3 和 CD8（或 CD4）下调的细胞；
（10） 按选定的两个区域建立散点图，显示细胞因子与 CD69 的染色；
（11） 用阳性对照样品（如，SEB-刺激的），划出一个「应答区」，此区域包括了所有 CD69 和细胞因子双阳性的细胞。如果用的是自动设门，应答区被习惯性划为双阴性群（门自动定义的）；
（12） 记录每个样品每个对应区域的阳性百分数，用每个刺激样品的细胞阳性百分数减去非刺激细胞（阴性对照）的对应数字得到抗原特异的净反应值；
（13） 如果需要，百分数可以通过乘以供血者每毫升 CD4 或 CD8 的计数值转化为每毫升血液中绝对反应细胞数。
来源：丁香实验
