细胞内细胞因子检测法也称 ICK 法，这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运，使得细胞因子聚集、蓄积。FCM 在临床、科研中的广泛应用，与细胞内细胞因子（intracellular cytokine，ICK）染色技术相结合，可提供一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法，这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
本法测定的是细胞因子的前体分子，测定的对象是单一细胞。除了测定经常表达和病理情况下亢进表达的细胞因子时可直接取样品细胞测定外，一般要用适当活化条件先活化细胞，使之合成和蓄积待测细胞因子。活化 T 细胞除用抗原外，主要是植物血凝素（PHA）、佛波酯（PMA）、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体 A23187、T 细胞受体抗体或 CD3 的抗体等；活化 B 细胞除抗原外，多用脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素 A 及 B 细胞受体抗体；活化单核细胞用 LPS 和某些细胞因子。
细胞内细胞因子检测法的基本原理是通过体外多克隆激活剂，如佛波酯（PMA）和离子霉素（ionomycin）或特定的抗原激活细胞，同时用 monensin 或布雷菲德菌素 A（brefeldin A，BFA）阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，抑制细胞因子释放到细胞外，从而使产生的细胞因子在细胞质内蓄积，信号增强。经多聚甲醛固定和皂角苷破膜增加细胞膜的通透性后，用抗细胞因子的抗体与细胞内特定的分子相结合，通过使用非相关特异性同型匹配的抗体作为对照，以确定静止的与无细胞因子分泌的细胞的最小荧光背景。这样就可用 FCM 检测不同细胞亚群分泌的细胞内细胞因子。
细胞内细胞因子检测法的基本过程可分为如下几步：
（一）细胞制备和激活
（1）分离人外周血单个核细胞（PBMC）
1）取 5 ml 肝素抗凝的人外周血于 15 ml 离心管中；
2）等体积的 1xPBS，混匀；
3）另取一 15 ml 离心管，加入 3 ml 淋巴细胞分离液，将稀释的全血缓缓加到淋巴细胞分离液面上，2000 r/min 离心 20 分钟；
4）吸取白色的单个核细胞层于另一离心管中，加入 5 ml 1xPBS，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清；
5）用 5 ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清。
（2）刺激人 PBMC
1）用 5 ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度为 1x106 个/ml - 2x106 个/ml；
2）将 5 ml 细胞悬液转移至无菌培养瓶中，根据实验设计加入细胞刺激剂和 monensin 或布雷菲德菌素 A，混匀；
3）将培养瓶放入 37℃ 5％ CO2 孵箱内培养 4-6 小时；
4）收集培养细胞，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清；
5）用 5 ml 完全培养液重悬细胞，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清。
细胞设门在 CD4T 细胞后，分析其 IFN-y 和 IL-2 的产生情况。结果表明，抗原特异性 CD4T 细胞可分为三个亚群，单独表达 IFN-Y 者为 0.09％，同时表达 IFN-y 和 IL-2 者为 0.05％，单独表达 IL-2 者为 0.02％。
（二）细胞固定和破膜
（1）向收集的培养细胞中加入 500μl 4℃ 预冷的固定液，混匀，室温反应 20 分钟；
（2）加入 2 ml 破膜剂，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清；
（3）加入 2 ml 破膜剂重悬细胞，1500 r/min 离心 5 分钟，弃上清；
（4）用适量破膜剂重悬细胞，调整细胞浓度为 2x106 个/ml，室温放置 10 分钟。
（三）细胞内染色
（1）取四支流式管（可根据需要增加标本管数），分别加入 50μl 破膜剂（空白对照管）、10μl PE 标记的同型对照、10μl 抗人 IFN-y-PE 或 10μl 抗人 TNF-α-PE;
（2）向每管加入 100μl 细胞悬液，室温避光反应 15 分钟；
（3）每管加入 1 ml 破膜剂重悬细胞，1000 r/min 离心 5 分钟，弃上清；
（4）加入 0.3 ml PBS 洗液重悬细胞。
（四）上流式细胞仪获取数据及分析
（五）结果如图 20-1，BCG 诱导了抗原特异性记忆 CD4＋T 细胞的 IFN-y 和 IL-2 产生，未能诱导抗原特异性记忆 CD8＋T 细胞产生 IFN-y 和 IL-2。图 20-2 显示细胞设门在 CD4＋T 细胞后，分析其 IFN-y 和 IL-2 的产生情况。结果表明，抗原特异性 CD4＋T 细胞可分为三个亚群，单独表达 IFN-Y 者为 0.09％，同时表达 IFN-y 和 IL-2 者为 0.05％，单独表达 IL-2 者为 0.02％。
1．外周血标本应用肝素抗凝，避免使用螯合钙的抗凝剂，如：EDTA、ACD 等。
2．避免 LPS 等强细胞激活剂污染，影响实验结果。
3．血样应在 8 小时内分析，超过 8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少 5％。如不能在 8 小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
4．细胞刺激剂置-80℃ 保存，需干冰运输。使用前迅速解冻，勿反复冻融，否则会失效。
5．破膜剂的作用是可逆性的，所以细胞内染色的全过程均需在有破膜剂的环境中进行。
6．细胞刺激剂和所有标记抗体中均含有毒物质，操作时需防止吸入及与人体直接接触。
7．若同型对照管的背景很高，需在固定、破膜前向培养细胞加入正常血清，以封闭人 PBMC 上的 Fc 受体。
8．若同时做细胞表面染色，则需在细胞固定、破膜前进行染色。
