简介
特异性定量检测可溶性细胞因子或趋化因子一般釆用夹心 ELISA 技术, 细胞因子夹心 ELISA 的实验方法是用高纯度的抗细胞因子的抗体 (捕获抗体) 非共价吸附在塑料微孔板上。板子经过洗涤后，固定的抗体可特异性捕获样本中存在的可溶性细胞因子蛋白。洗涤未结合的物质，通过加酶标记的抗细胞因子抗体 (检测抗体) 来检测被捕获的细胞因子。最后加显色底物溶液，显色的程度通过 ELISA 酶标检测仪测定光密度 (optical density，OD) 记录。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出 OD 值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
原理
夹心 ELISA 法一般用抗同一细胞因子不同表位的两个单克隆抗体。一个抗体用于包被作捕捉抗体用；另一个抗体分子标记酶，作为检测抗体。单克隆抗体亲合力识别表位均一，质量控制比较容易，商品化的检测盒大多采用双单克隆抗体夹心法。
材料与仪器
器材：聚苯乙烯塑料板，ELISA 检测仪，37℃ 水浴箱，4℃ 冰箱，CO2 孵箱，可调加样器。
试剂：
① 缓冲液；
② 洗涤液；
③ 稀释液；
④ 终止液；
⑤ Tac ELISA 试剂盒，包括 Tac 特异性单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的 Tac 特异性单克隆抗体，底物（ABTS）。
步骤
酶联免疫吸附剂实验法定检测可溶性细胞因子的基本过程可分为如下几步：
A.Ab1 包被：用 0.05M pH9.6 碳酸盐包被缓冲液将抗 Tac 特异性单克隆抗体（Ab1）稀释至 5 μg/ml，加至 ELISA 板，每孔 100μl，4℃ 包被 14 h。
B. 封闭：1% BSA-PBS 封闭，每孔 200μl,37℃ 孵育 2 h。
C. 加样：ELISA 板用 PBS-T 洗液洗 3 次，分别加入样品、标准品以及 100μl 同质溶液为阴性对照。37℃ 孵育 2 h，洗涤。标准品的稀释按照检测需要覆盖的浓度范围选择最高浓度后进行倍比稀释，标准品的最高浓度高于样品浓度最高限一个梯度，最低浓度至少低于样品浓度一个梯度。
D. 加酶标抗体：于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗 Tac 特异性单克隆抗体 Ab2，以效价滴定的最佳稀释度稀释 100μl，37℃ 孵育 2 h，洗涤。
E. 加底物显色：各反应孔加新鲜配制 ABTS 底物溶液 100μl，37℃，孵育 15 min。
F. 终止反应：各反应孔加 2% 氟化钠终止液 50μl。
G. 结果判定：ELISA 检测仪上测各孔 OD 值（410nm）。
注意事项
1. 包被抗体活性要较高，否则影响本实验敏感性。
2. 经筛选比较，封闭液以 1% BSA-PBS 为好。
3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定，选择最佳工作浓度。
4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如 ABTS 等。
5. 如有条件，酶标 McAb 可由生物素-McAb 和亲和素-HRP 系统代替，以增加实验的敏感性。
来源：丁香实验
