ELISA 法检测的是可溶性细胞因子蛋白总量，而 ELISPOT 是检测分泌该蛋白的细胞的频率，是单细胞水平检测，比 ELISA 法更灵敏，能从 20 万-30 万细胞中检出 1 个分泌该蛋白的细胞。
固相酶联免疫斑点技术的基本原理是在 96 微孔培养盘底部披覆 PVDF 薄膜，用来吸附特殊无毒性 ［不含叠氮钠（sodium azide）、内毒素（endotoxin）］ 的单克隆抗体。静脉血 PBMC 细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型 T 细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部（在紧靠分泌细胞的周围）分泌出的细胞因子会被 PVDF 薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步与生物素（biotin）标记的二次抗体结合，其后再以结合酵素的 StreptAvidin 与之作用，并加入酵素基质使其呈色，有分泌作用的细胞会留下约 10-20 mm 大小染色的斑点，可以通过 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。在双色标记系统中，可同时检测两种细胞因子的分泌细胞频率。
固相酶联免疫斑点技术操作简便，但却能提供非常类似于体内实验的环境，现已广泛运用于实验室的疾病诊断和科学研究活动之中，如监视癌症患者接受免疫疗程时的反应，以及感染性疾病、肿瘤或自体免疫性疾病患者体内的一个特定的免疫反应形式。
ELISPOT 技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重的评估指标。2003 年 1 月，世界卫生组织通过与中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心（简称性艾中心）合作，将应用 ELISPOT 技术来监测 HIV 疫苗研究免疫应答反应技术。
ELSPOT 技术在移植研究、ThO／Th1／Th2 细胞转换分析、抗原决定位定图、体液免疫力研究、自身免疫研究、过敏机制探讨及一些传染疾病研究中大显身手。
固相酶联免疫斑点技术的基本过程可分为如下几步：
ELISPOT 检测抗原特异性细胞频率。
A. 用 100μl 70％ 乙醇孵育 PVDF 孔板，室温下孵育 10 分钟。
B. 倒去乙醇，用 100μl PBS 洗涤 3 次。
C. 将 100μl 捕获抗体加入 10 ml PBS 中，混合，每孔加 100μl，盖上板盖，4℃ 过夜。
D. 倒去液体，100μl PBS 洗涤 1 次。
E. 每孔加入 100μl 含 2％ 脱脂乳 PBS，盖上板盖，室温下孵育 2 小时。
F. 在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
G. 用 100μl PBS 洗涤 1 次。
H. 每孔加入 100μl 细胞悬浮液，细胞可预先在体外接受刺激。盖上标准的 96 孔板塑料板盖，37℃ CO2 孵育箱中孵育一定的时间（15-20 小时）。这期间不要晃动或移动孔板。
I. 在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
J. 每孔加 100μl 洗涤缓冲液，4℃ 孵育 10 分钟。
K. 用 100μl 洗涤缓冲液洗孔 3 次。
L. 于 10 ml PBS（含 1％ BSA）中稀释 100μl 检测抗体，此为一板的量。每孔加 100μl 此液体，盖上板盖，37℃ 下孵育 90 分钟。
M. 倒去液体，用 100μl 洗涤缓冲液洗 3 次。
N. 每板以 10 ml PBS（含 1％ BSA）稀释 10μl 的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入 100μl 此液体，盖上板盖，37℃ 孵育 1 小时。
O. 倒去液体，用 100μl 洗涤缓冲液洗 3 次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。
P. 每孔加入 100μl BCIP/NBT。
Q. 室温下反应 5-15 分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。
R. 用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。
1．微孔板中加样时不要接触孔底，以防止损坏 PVDF 膜。
2．为了确定 ELISPOT 检测的最适细胞浓度，第一次实验时加的细胞浓度范围应宽一些（如：103-106 个细胞/孔）。
3．细胞培养过程中不要晃动培养箱或 ELISPOT 板。
4．实验完成后，吹干板的温度不要超过 37℃，以免 PVDF 膜破裂。
5．实验完成后，为了保存颜色反应，风干的微孔板应保存在密封的塑料袋中，避免板孔暴露于空气和光线下。
6．实验应设阳性对照孔和阴性对照孔，推荐以下对照设定：
（1）阳性对照：重组细胞因子或确定能分泌该种细胞因子的细胞。
（2）阴性对照：相同数量的未刺激细胞。
（3）背景对照：无菌细胞培养液。
（4）检测抗体对照：用 PBS 代替检测抗体。
7．加入 BCIP/NBT 显色后，用双蒸水清洗会导致蓝黑色的背景和斑点衰减，可能因为 PVDF 膜是湿的，应该在 PVDF 膜完全干燥后进行分析：将板放置 37℃ 15-30 分钟或室温 60-90 分钟即可完全干燥。4℃ 下放置过夜，点会比较明显。
8．出现板孔中斑点数量多而阳性对照孔斑点数量很少，可能原因是孵育不完全，碱性磷酸酶-酶亲和素和 BCIP/NBT 显色液没有平衡到室温，因此使用之前将所需试剂平衡至室温。
9．板孔中斑点密度太高是因为板孔中细胞数量太多，建议稀释细胞，用不同细胞数作预实验，如每孔 1x106,5x105,1x10,5x104,1x104 以确定最佳 细胞数量。
10．板孔里的斑点数量比预计要少而阳性对照孔正常，如果是因为细胞刺激不够，应保证用来刺激细胞的刺激剂具有很好的生物学活性，可在刺激完成后通过免疫细胞化学来鉴定刺激效果；如果是因为板孔中细胞数量太少，就增加细胞数量。
