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🔥 采用 qRT-PCR 检测细胞炎性因子

相关实验:细胞因子检测

别名:real-time RT-PCR,qPCR ,RT-qPCR,Quantitative real-time PCR,qrt-pcr

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 赵金兰硕士

生物化学分子生物 中国计量大学

丁香实验推荐阅读

审核专家 | 李娜硕士

生理学 大连医科大学

原理

qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列,并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量,来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。

用途

广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。

材料与仪器

试剂:

RNA 提取试剂盒、反转录试剂、qRT-PCR 试剂盒、细胞炎性因子引物(探针法还需要一个探针)、PBS、DEPC 水等;

材料:

无 RNA 酶、EP 管及八连排 PCR 管、无 RNA 酶的枪头等。

步骤

(1)细胞培养:将待检测的细胞接种在培养皿中,依据实验目的处理细胞,待收集细胞时,用 PBS 轻柔清洗 2~3 次以去除培养基对后续试验的干扰。

(2)RNA 提取:使用 RNA 提取试剂盒,从细胞中提取总 RNA,并使用紫外分光光度计检测 RNA 浓度和纯度,A260/A280 在 1.8~2.1,表明 RNA 样品可用。RNA 很不稳定,易降解,建议测定完成后尽快进行反转录反应。

(3)cDNA 合成:根据反转录试剂说明书分为两步,一是去除基因组 DNA,二是反转录反应获取 cDNA。此步骤完成后可将 cDNA 冻存于-80℃ 以备用。

(4)qRT-PCR 反应:设计并合成引物,随后以 cDNA 为模板,使用细胞炎性因子的特异性引物进行 qRT-PCR 扩增反应。反应完成后,确认扩增曲线和融解曲线,对标准曲线进行分析。

(5)数据分析:使用 qRT-PCR 仪检测荧光信号,导出 Ct 值,以β-actin 作为内参基因,采用 2-△△CT 法来计算细胞炎性因子的表达水平。

注意事项

(1)RNA 提取:RNA 提取的质量和纯度对于后续的 cDNA 合成和 qRT-PCR 检测都非常关键。需要使用高质量的 RNA 提取试剂盒,并严格按照说明书操作。在提取 RNA 的过程中需要注意避免 RNA 的降解和污染。

(2)cDNA 合成:cDNA 合成是将 RNA 转录成 cDNA 的过程,需要选择适当的逆转录酶、引物和反应条件。在反转录前需要对 RNA 进行 DNA 酶消化,避免 DNA 污染影响后续的 qRT-PCR 检测。

(3)引物和荧光探针设计:对于细胞炎性因子的检测,需要设计特异性的引物和荧光探针,以确保只扩增目标序列并减少假阳性的发生。可以使用在线工具(Primer3 等)设计合适的引物和荧光探针,也可以向商家购买。

(4)若 SYBR Green 染料法,在 qPCR 反应体系中,需根据 PCR 仪器型号选择是否加入 ROX 染料。

(5)数据分析:qRT-PCR 检测的结果需要通过数据分析软件进行处理。需要注意数据的标准化和统计学分析。同时,需要对实验结果进行验证和重复实验,以确保结果的可靠性。

常见问题

(1)RNA 提取问题:RNA 提取的质量和纯度对于后续的 cDNA 合成和 qPCR 检测非常关键。如果 RNA 提取质量不好,可能会影响后续的实验结果。常见的问题包括 RNA 降解、DNA 污染、重复性差等。

(2)引物和荧光探针问题:引物和荧光探针的选择和设计对于实验结果的准确性和可靠性非常重要。如果引物和荧光探针选择不当或设计不合理,可能会导致实验结果的偏差或误差。

(3)对照组设置问题:在实验设计时需要设置对照组,包括阴性对照和阳性对照。如果对照组设置不当或者没有设置对照组,可能会导致实验结果的不可靠性。

(4)数据分析问题:qPCR 检测的结果需要通过数据分析软件进行处理,如果数据分析不当或者数据分析软件设置不合理,可能会导致实验结果的不准确性或者误差。

(5)实验重复性问题:实验重复性是衡量实验结果可靠性的重要指标。如果实验重复性差,可能会导致实验结果的不可靠性和误差。

来源:丁香实验

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