Realtime（qPCR）实验进阶

qPCR 是一种相对表达定量的方法，real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。Real-time qPCR 因为其灵活的操作性、良好重复性等优点发展迅速。SPSS　(Statistical Product and Service Solutions) 是一个组合式软件包，它集数据录入、整理、分析功能于一身。2010 年被 IBM 并购 S

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 ddH20 2. 酶和酶缓冲液 10X Vent 缓冲液 Vent DNA 聚合酶 3. 核酸和寡核苷酸 dNTP，各 20 mmol/L PCR 引物，可以与基因组 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火 质粒 DNA(见下面第 1 步） 4. 特殊设备 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭 (见第 5 步） 热循环仪 二、方

dNTP ，PCR 缓冲液，聚合酶混合液，嵌套引物，LB-氨苄液体培养基，溶液NaOH，SSC，Tris-HCl，PCR 产物 微量滴定板，尼龙膜，紫外交联装置，96 孔或 384 孔复制器，热循环仪，PCR 管或反应板

PCR 法检测支原体污染是 20 世纪 80 年代中期建立起来的一种体外 DNA 扩增实验，其该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。

qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列，并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量，来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究

实时定量PCR依靠荧光标记物和自动化仪器，每次循环都可读出荧光强度，实时监测了反应进程中的PCR产物，从而更精确地实现了对模板样品的定量及定性的分析。

由于成熟miRNA的长度仅为约22nt,无法进行PCR扩增反应．所以在进行该法检测之前，要对所提取的miRNA进行结构上的处理。一般的做法是在成熟miRNA的一端连接上一段已知序列的核苷酸，经反转录后，再以此为模板进行后续的PCR扩增。目前常用的是茎环法和加尾法。

定量 PCR 是指以一种标准作对照，通过对 PCR 终产物的分析或 PCR 过程的监测，对 PCR 起始模板量进行定量的技术。根据原理的不同，目前主要采用的定量 PCR 方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量 PCR、荧光定量 PCR （fluorescence quantity PCR，FQ-PCR）等。其中荧光定量 PCR 是最新发展起来的一项定量 PCR 技术。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

DEPC 处理方法如下1. DEPC处理（1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。（2） Tip头(枪头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取RNA，用

实时荧光定量 PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA 的提取不同组织样本的 RNA 提取适用不同的提取方法，在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；取 2 μg 进行 RNA 的甲醛变性胶电泳检测，如果存在 DNA 污染时，要用 DNase I 进行消化（因为在处理过程中 RNA 极易降解，建议体系中加入适量 RNA 酶抑制剂）。二、DNase I 消化样品 RNA

随着近年来 PCR 技术及流式细胞术的发展，实时定量 PCR（quantitativePCR，qPCR）技术及流式荧光原位杂交法（flow-fluorescence in situ hybridization，Flow- FISH）等操作相对简单、结果直观的方法也被用来显示端粒的长度。