Realtime（qPCR）实验进阶

qPCR 是一种相对表达定量的方法，real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。Real-time qPCR 因为其灵活的操作性、良好重复性等优点发展迅速。SPSS　(Statistical Product and Service Solutions) 是一个组合式软件包，它集数据录入、整理、分析功能于一身。2010 年被 IBM 并购 S

1、在细菌中扩增后，用基因组文库制备的质粒 DNA 建立下列反应。10~50ng 的质粒 DNA50pmol 的各引物5ul 的 10XVent 缓冲液dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul1U 的 Vent DNA 聚合酶用 ddH2O定容至 50ul对下面的每种质粒载体应该分别进行反应：表达载体，没有文库 DNA 插入基因组 DNA 文库的混合物少量 DNA, 由基因组

通过 PCR 扩增 DNA 插入片段1、从文库中随机挑取 96 个或 384 个白色的细菌菌落。2、在一个 PCR 板上，每个菌落用 150ul LB-氨苄培养基 37°C 下轻轻振荡培养，时间至少为 4 h（或过夜）。3、配制用于 100 个或 400 个 PCR 的主体混合液。4、将 19 ul 主体混合液分装到每个管子或反应板的每个孔中。5、从每个细菌培养液（见上面第 2 步）中，各取 1

实验试剂准备。1. 吸出汇片生长单层细胞的培养基。（1） 对于 XGPRT 筛选，用 BS-C-1 细胞；（2） 对于 TK 筛选，用 HuTK-143B 细胞。2. 用 37 ℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗细胞 1 次，以除去剩余血清。3. 用刚好覆盖单层细胞、37 ℃ 的胰酶/EDTA（对于 150 cm2 培养瓶需要 1.5 ml）覆盖细胞。消化 30 s （细胞应该分开），晃动培养瓶

PCR 法检测支原体污染是 20 世纪 80 年代中期建立起来的一种体外 DNA 扩增实验，其该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。

qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列，并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量，来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究

实时定量PCR依靠荧光标记物和自动化仪器，每次循环都可读出荧光强度，实时监测了反应进程中的PCR产物，从而更精确地实现了对模板样品的定量及定性的分析。

由于成熟miRNA的长度仅为约22nt,无法进行PCR扩增反应．所以在进行该法检测之前，要对所提取的miRNA进行结构上的处理。一般的做法是在成熟miRNA的一端连接上一段已知序列的核苷酸，经反转录后，再以此为模板进行后续的PCR扩增。目前常用的是茎环法和加尾法。

定量 PCR 是指以一种标准作对照，通过对 PCR 终产物的分析或 PCR 过程的监测，对 PCR 起始模板量进行定量的技术。根据原理的不同，目前主要采用的定量 PCR 方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量 PCR、荧光定量 PCR （fluorescence quantity PCR，FQ-PCR）等。其中荧光定量 PCR 是最新发展起来的一项定量 PCR 技术。

一、 样品 RNA 的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。2. 两相分离每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30 ℃ 孵育 2 到 3 分钟。4 ℃ 下 12 000 rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中

DEPC 处理方法如下1. DEPC处理（1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。（2） Tip头(枪头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取RNA，用

实时荧光定量 PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA 的提取不同组织样本的 RNA 提取适用不同的提取方法，在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；取 2 μg 进行 RNA 的甲醛变性胶电泳检测，如果存在 DNA 污染时，要用 DNase I 进行消化（因为在处理过程中 RNA 极易降解，建议体系中加入适量 RNA 酶抑制剂）。二、DNase I 消化样品 RNA

随着近年来 PCR 技术及流式细胞术的发展，实时定量 PCR（quantitativePCR，qPCR）技术及流式荧光原位杂交法（flow-fluorescence in situ hybridization，Flow- FISH）等操作相对简单、结果直观的方法也被用来显示端粒的长度。