简介
PCR 法检测支原体污染是 20 世纪 80 年代中期建立起来的一种体外 DNA 扩增实验，其该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。
原理
PCR 法检测支原体污染的基本原理是酶促 DNA 合成反应，即在 DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经 DNA 聚合酶的作用，使 DNA 链扩增延伸。
材料与仪器
器材：
① 支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean 树脂、缓冲液；美国 Stratagene 公司生产）
② dNTP
③ Taq DNA 聚合酶
④ 缓冲液
⑤ 琼脂糖
⑥ 矿物油
⑦ 超净工作台
⑧ PCR 仪
⑨ 电泳仪
⑩ 凝胶成像分析系统
⑪ 台式离心机
⑫ 旋涡混悬器
步骤
PCR 法检测支原体污染的基本过程可分为以下几步：
（1）样品的收集
待测细胞用无双抗培养基培养 7 d，用无菌容器取上清液 500 μl，4 ℃ 保存待测。
（2）模板的制作
在无菌的条件下，取细胞培养上清液 100 μl 于一无菌的 0.5 ml 塑料离心管内，盖好盖子，95 ℃ 水浴加热 5 min。
（3）打开盖子，向管内加 StrataClean 树脂 10 μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心 5～10 s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4 ℃ 保存。
（4）PCR 反应反应体系最适条件为：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.38），50 mmol/L KC1，1.5～2.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，2U Taq DNA 聚合酶；总反应体系为 50 μl，反应用去离子水均需用 12000 μJ/c㎡紫外灯照射。
A. 在 0.5 ml 塑料离心管中加入 35.2 μl 去离子水及 5 μl 10 x Taq 反应缓冲液。
B. 依次加入下列成分：0.4 μl dNTP（25 mmol/L）；0.4 μl Taq 酶（5 U/μl）；2 μl 引物。
C. 加 2 μl 去离子水，总体积 45 μl。
D. 加 5 μl 已制成的模板到反应体系中。
E. 阳性对照、内对照各 5 μl 加入到各自的反应体系中。
F. 取 1 支含有以上反应体系的离心管，加入 5 μl 去离子水作为阴性对照管。
G. 在反应体系中加入 100 μl 矿物油。
H. PCR 程序：
| 程序 | 循环数/次 | 温度/℃ | 时间/min | 程序 | 循环数/次 | 温度/℃ | 时间/min |
| 1 | 1 | 94 | 2 | 2 | 40 | 94 | 1 |
| 50 | 2 | 50 | 1 | ||||
| 72 | 2 | 72 | 2 |
（5）琼脂糖凝胶电泳
PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度 2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。
注意事项
1. PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。
2. 检测前，待测细胞要用无双抗培养基培养 7 d。
来源：丁香实验
