细胞支原体污染的PCR检测

支原体菌株来源：

M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体

M.FermentaneATCC19989发酵支原体

M.SalivariumATCC23064唾液支原体

M.HominisATCC23114人型支原体

M.OraleATCC23714口腔支原体

M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体

其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。

ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ 2 、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。

下面是更详细的：

污染测试——支原体：PCR方法

原理： 利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。

特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。

缺点：PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。

材料与设备：

ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.

提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture

positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)

PCR reagents :

Taq polymerase ( 5 U / ul )

dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )

10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)

25mM MgCl2

sterile ddH2O

Machine / Equipment：

PCR thermal cycler

agarose电泳设备

DNA电泳胶体观察设备

无菌PCR反应管

无菌1.5 ml微量离心管

无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法： 此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果：使用UV light观察，并照相记录。

不过应用较多还是巢式PCR

方法：此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。

结果：使用UV light观察，并照相记录。

方法再详尽点：st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：

测试样品 ( 2 ul / each )

直接取样测试细胞之培养液。

Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )

Negative control : ddH2O

Reaction mixture ( 23 ul / each )

10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

1st stage primer mixture 0.5 ul

dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l

MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul

ddH2O 18.4 ul

PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler

step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min

step 4 : extension: 72 ℃ 2 min

重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles

step 5 : final extension 72 ℃ 5 min

2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）

测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each）。

Reaction mixture ( 24 ul / each )

10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

nd stage primer mixture 0.5 ul

dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul

MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul

ddH2O 19.4 ul

PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler

胶片电泳分析

胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。

电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）

选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )

取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。

进行电泳分离100V, 25 min。

胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）

结果：使用UV light观察，并照相记录。