你养的细胞，可能又被支原体污染了？
普健生物（武汉）科技有限公司
支原体（Mycoplasma）又称霉形体，广泛分布于自然界（有80余种），为目前发现的最小最简单的细胞，也是唯一一种没有细胞壁的原核细胞。支原体基因组为一环状双链DNA，分子量小，基因数量为480个，直径50-300 nm，能通过细菌滤器，大小介于细菌和病毒之间。菌落小（直径0.1-1.0 mm），在固体培养基表面呈特有的“油煎蛋”状。不能维持固定的形态而呈现多形性，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。
支原体是细胞培养中最常见的，干扰实验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在继续使用。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%受到支原体污染。因此，对支原体污染应严加防范。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染检测方法
01
分离培养法
分离培养法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端：
1检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。
2尽管它可以检测绝大多数支原体种类，但也有力所不及的时候，比如分离培养法就不能检出支原体M. hyorhinis菌株的存在。
如果实在不想等这么久，或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果，可以试一试酶学检测法、ELISA法、DNA染色法或PCR法。不过需要注意的是，上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体，而且灵敏度也没有分离培养法高，所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。
02
酶学检测法
酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。
03
ELISA检测法
ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。
04
DNA荧光染色法
需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。DNA法则可以准确的将分离培养法不能检测的支原体M. hyorhinis菌株检测出来。国际支原体组织（IOM）推荐分离培养法和DNA荧光染色法作为常规检测方法。
但最近PCR法的发展令人鼓舞
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05
PCR检测法
PCR法检测支原体只需几个小时，是最快也是最灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。
普健生物生产的支原体PCR检测试剂盒（Mycoplasma PCR Test Kit）是一款具有快速、灵敏、特异性高等特点的支原体检测试剂盒，可用于细胞、培养基、动物血清等的支原体检测。本产品通过聚合酶链式反应技术（PCR）特异扩增支原体16s-rRNA 基因保守区域片段进行支原体检测，能够检测包括M. arthritidis， M. hominis，M. hyorhinis，M. fermentans，M. orale，M. salivarium，M. bovis，M. bovigenitalium，M.pneumoniae，M. pirum等在内的数十种支原体。
-15 ~ -25℃保存，自检定合格之日起有效期为12个月。
收取待检样品
贴壁细胞：待细胞生长至80%左右即可，使用细胞刮刀刮取细胞（送检细胞不能用消化液消化细胞）。
悬浮细胞：待细胞生长至80%左右即可直接进入下一步离心。
注：一般以6孔板接种细胞，当细胞生长至80-90％时即可取样进行检测。培养液中的青霉素和链霉素不会影响检测效果。
1000 rpm离心5 min，弃上清，留100-200 μl培养基重悬细胞，沸水浴10 min。
将煮沸的细胞悬浮液12000 rpm离心3-5 min。
所得样品取4ul直接用于PCR检测，或冻存于-20℃备用。
充分融化PCR反应液，按照下表配制PCR反应体系：
将所有PCR反应管放入PCR仪，按照以下参数运行PCR反应程序：
05
取5 ul PCR产物（无需再加溴酚蓝），进行1%琼脂糖凝胶电泳：110V电泳20-30 min，根据电泳仪情况，适当调整电泳参数。
支原体阳性细胞扩增片段在270 bp左右
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电泳参考图
（M：marker，+：阳性，-：阴性，1-3：检测为阳性的细胞，4-5：检测为阴性的细胞）
使用该试剂盒还有一些
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2 为保证结果可靠性，建议每次实验都有阳性和阴性对照，每个反应各加4μl，阳性对照随试剂盒提供，阴性对照为灭菌ddH2O，需客户自己准备。
3 操作时应尽量少说话，或带口罩，因口腔中也含有支原体，可能引起样品污染，而造成假阳性。
5 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
6 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
