PCR 法

实验试剂准备详见「其他」。

1. 吸出汇片生长单层细胞的培养基。

1.1 对于 XGPRT 筛选，用 BS-C-1 细胞。

1.2 对于 TK 筛选，用 HuTK-143B 细胞。

2. 用 37℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗细胞 1 次，以除去剩余血清。

3. 用刚好覆盖单层细胞、37℃ 的胰酶/EDTA（对于 150 cm² 培养瓶需要 1.5 ml）覆盖细胞。消化 30 s （细胞应该分开），晃动培养瓶使细胞完全分开。

4. 加入 8.5 ml 适当培养基。

4.1 对于 BS-C-1 细胞，使用完全 MEM-10 培养基

4.2 对于 HuTK-143B 细胞，使用完全 MEM-10/BrdU 培养基。吸打细胞悬液数次使团块散开。

5. 用血球计数器对细胞进行计数。

6. 将 1.25 ×10⁵ 细胞/孔放入 24 孔组织培养板培养（每孔终体积为 0.5 ml），至细胞汇片（应小于 24 h）。

7. 将小管中的病毒置于冰水上，在杯状超声仪上以最大功率超声 20~30 s。

8. 吸出组织培养板中的培养基，用一个重组病毒噬斑感染一个孔的细胞，一般用噬斑悬液的一半体积（如有0.5 ml 的噬斑悬液用 0.25 ml），温育 1~2 h，期间每隔 15~30 min，轻轻摇晃培养瓶。

9. 加入 1 ml 含适当筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基，培养直到细胞病变（细胞变圆）明显（一般 24~48 h）。

9.1 对于 XGPRT 筛选，加入 1/400 体积的 10 mg/ml MPA、1/40 体积的 10 mg/ml 黄嘌呤、1/670 体积的 10 mg/ml 次黄嘌呤。

9.2 对于 TK 筛选，加入 1/200 体积的 5 mg/ml BrdU。

10. 用细胞刮刀轻轻刮下细胞，转移到离心管中，最大转速离心 30 s。弃培养基；再加入 1 ml PBS，涡旋混匀，最大转速离心 30 s 弃 PBS，用 0.5 ml PBS 重悬。

11. 反复冻融法裂解细胞悬液：用干冰/乙醇冷冻细胞，再将细胞放入 37℃ 水浴锅，且涡旋解冻。如此进行 3 次。

12. 将重悬的细胞悬液置于冰水混合物上，在杯状超声仪上以最大功率超声 20~30 s。

13. 取 50~100 μl 细胞悬液移至微量离心管中。加入 1/10 体积的 DNA 提取缓冲液，轻轻翻转数次使其混合，37℃ 放置 2 h 至过夜。

14. 用等体积的平衡苯酚抽提 1 次，再用等体积的氯仿抽提 1 次。

15. 加入 1/10 体积 pH 6.0，3 mol/L 的乙酸钠（终体积为 0.3 mol/L）和 1.5 体积 95% 的乙醇。 -20℃ 放置 20 min。

16. 4℃ 以最大转速离心 15 min，弃上清。用冰浴的 70% 乙醇洗涤，空气中晾干。

17. 用 20 μl 去离子水溶解沉淀。在冰上配制下列反应混合物：

10 μl 溶解的模板 DNA

5 μl 10 × 无 MgCl₂ 的 PCR 扩增缓冲液

5 μl 10 mmol/L 4 dNTP 混合物

5 μl 100 μmol/L 引物

5 μl 15 mmol/L MgCl₂

24.5 μl H₂O

覆盖上矿物油。

此步骤使用高保真的 PCR 试剂盒（BoehringerMannheim）更好。

18. 用下列热循环参数进行 PCR 反应。

35 个循环：20 s 95℃ （变性）

20 s 55～60℃ （复性）

1~2 min 72℃ （延伸）

1个循环：5 min 72℃ （延伸）

最后一步：无限时 4℃ （保存）

此条件适合扩增 1 kb 大小的片段。

19. 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。

1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养，除非有特殊说明。

2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。

试剂：

磷酸缓冲液（PBS）

胰酶/EDTA（0.25%:0.02%），37℃

完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基

完全 MEM-10/BrdU 培养基

筛选试剂（过滤除菌，-20℃ 保存）：

10 mg/ml（400×）麦考酚酸（MPA；Calbiochem），溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 筛选）；

10 mg/ml（40×）黄嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 筛选）；

10 mg/ml（670×）次黄嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 筛选）；

5 mg/ml（200×）5-溴脱氧尿苷（BrdU），溶于水（TK 筛选）

干冰/乙醇

DNA 提取缓冲液

3 mol/L 乙酸钠，pH 6.0

95% 和 70% 冰浴的乙醇

10 × 无 MgCl₂ 的 PCR 扩增缓冲液

10 mmol/L 4 dNTP 混合物

100 μmol/L 引物（序列按照插入的外源基因的位点设计）

15 mmol/L MgCl₂