痘苗 DNA 检测实验

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

除了 PCR 和 Southern 杂交可以检测病毒 DNA 外，也可以利用 DNA 点迹杂交方法检测在分离的噬斑中的重组病毒。本实验主要介绍用这3种方法来检测痘苗DNA。

内容来源《精编分子生物学实验指南（第五版）》

来源：丁香实验

操作方法

PCR 法

实验试剂准备详见「其他」。1. 吸出汇片生长单层细胞的培养基。1.1 对于 XGPRT 筛选，用 BS-C-1 细胞。1.2 对于 TK 筛选，用 HuTK-143B 细胞。2. 用 37℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗细胞 1 次，以除去剩余血清。3. 用刚好覆盖单层细胞、37℃ 的胰酶/EDTA（对于 150 cm2 培养瓶需要 1.5 ml）覆盖细胞。消化 30 s （细胞应该分开），晃

斑点杂交法

1. 病毒感染细胞并完成筛选（见「PCR 法」步骤 1~9）。2. 轻轻刮下细胞，转移到离心管中，最大转速离心 30 s，弃培养基，用 200 μl PBS 重悬。24 孔培养板中的细胞也可用 1ml 的注射器的活塞刮取。3. 冻融并超声细胞悬液（见「PCR 法」步骤 11、12）。4. 将硝酸纤维素膜剪至适合点迹仪大小，将其用水浸湿，放入仪器中，每孔中加入 20~100 μl 的细胞悬液（步骤

Southern 杂交法

1. 用生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞建立用于病毒感染的细胞培养液（见基本方案 1 步骤 1~5）。2. 用完全 MEM-10 培养基将 2.5 × 105 细胞/孔放入 12 孔组织培养板培养（每孔终体积为 1 ml），细胞汇片生长（应小于 24 h）。3. 在使用前，将一定体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合，涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min，并在保温过程